基于毒效成分含量的正交试验优选苍耳子炮制工艺

黄保生，黄成，韩燕全*，朋汤义*，金传山，吴德玲

(1.安徽中医药大学第一附属医院,国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031；2.安徽中医药大学 中药复方安徽省重点实验室,现代药物制剂安徽省工程技术中心，安徽 合肥 230031)

苍耳子为菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟带总苞的果实，为临床常用中药。苍耳子性味辛、苦、温，有毒，具有散风寒、通鼻窍[1]、祛风湿、止痛、解毒杀虫的功效。主治风寒感冒、头疼鼻塞、鼻渊流涕、风疹瘙痒、风寒湿痹及肢体拘挛等[2]。苍耳子为传统中药，化学成分复杂，主要含苷类、挥发油类、脂肪油类、有机酸类、木脂素类、杂环类、黄酮类、蒽醌类、倍半萜内酯类等,具有抗炎镇痛、抗菌、抗病毒、抗过敏、降血脂、降血糖、抗癌等药理作用[3-5]。

研究表明，苍耳子中含有大量的酚酸类成分，具有良好的抗氧化、抗炎的作用，可抑制血小板凝集活性，是苍耳子发挥临床疗效的重要组分[6]。绿原酸作为苍耳子内含量最多的一类酚酸类成分，2020年版《中国药典》规定，其含量测定不得少于0.25%，以绿原酸为主的酚酸类成分被认为是主要抗炎镇痛活性成分。除绿原酸外，隐绿原酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸等咖啡酸衍生物也被推测为苍耳子抗炎镇痛的活性成分。苍耳子生品有毒，据报道羧基苍术苷、苍术苷和4’-去磺基苍术苷[7]为其主要毒性成分，此外苍耳子植物蛋白[8]被认为是其毒性成分之一。因此将绿原酸、隐绿原酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸这4种酚酸作为有效成分指标，结合毒性成分蛋白质做正交试验以优选其炮制最佳工艺。

对苍耳子及其炮制品的主要化学成分、药理作用等研究已有一定进展，但针对苍耳子及其炮制品的毒效结合研究还不够全面。本文在分析总结目前已有研究的基础上，运用UPLC法计算有效成分含量、BCA法计算蛋白质含量，采用正交法，优选苍耳子炮制工艺，以期为基于毒效成分优选苍耳子的炮制工艺提供借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪(Waters-Acquity，美国Waters公司);全波长酶标仪(1510型，Thermo Fisher Scienti-fic Oy Ratastie 2.FI-01620BVantaa.Fintand)；BS200S型十万分之一电子天平；KQ-300DE超声波清洗仪；KDC-16H离心机；DK-S24电热恒温水浴锅；SX-610pH计；XFB-200高速中药粉碎机。

1.2 试剂与药品

苍耳子购于安徽省亳州市沪谯药业有限公司(1911160062)，经安徽中医药大学第一附属医院李立华主任鉴定为菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr.的成熟带种苞的果实。对照品：绿原酸(DST180504-21)、隐绿原酸(MUST-11112203)、3，4-二咖啡酰奎宁酸(MUST-12041114)、4，5-二咖啡酰奎宁酸(MUST-11081803)均为成都曼思特生物科技有限公司生产；甲醇(20190905)和乙腈(75-05-8)为色谱纯；磷酸(101217)和石油醚(20190929)为分析纯；蒸馏水为屈臣氏水(20190524)；BCA蛋白定量试剂盒(R21250-250T，上海源叶生物科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 炒苍耳子制备

称取干净的苍耳子药材20 g，筛选除去杂质后，放入炒制容器内，加入15倍量砂，炒制一定时间后，迅速过筛、晾凉，粉碎待用。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱条件

Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) ；流动相为乙腈(A)和0. 1% 磷酸溶液(C),流速：0.25 mL/min,进样量：1 μL，柱温：30 ℃，检测波长327 nm[9]。梯度洗脱程序：0～2.5 min，3%～10%A；2.5～8.5 min，10%～15%A；8.5～14 min，15%～25%A；14～16 min，25%～40%A；16～18 min，40%～3%A；18～20 min，3%A。在该色谱条件下，炒苍耳子与混合对照品色谱图见图1。

在此色谱条件下，苍耳子中这4种酚酸成分峰形稳定，对各成分进行精密度试验，记录各成分峰面积，其峰面积RSD值介于0.075%～0.390%之间，说明该色谱条件稳定可行。

2.2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密吸取4种酚酸对照品溶液，加色谱醇甲醇定容，制成每1 mL分别含有90.60 μg绿原酸、15.15 μg隐绿原酸、2.06 μg 3,4-二咖啡酰奎宁酸以及1.12 μg 4,5-二咖啡酰奎宁酸混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取苍耳子粉末0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇(分析纯)10 mL，密封，称重，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇(同种分析纯)补足减失的重量，摇匀，0.22 μm滤膜过滤于棕色瓶，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液0.5，1，2，3，4，5 μL，按“2.2.1”项色谱条件进样，记录4种酚酸的峰面积。以各参比浓度(μg/mL)为X坐标，以峰面积为Y坐标，进行线性回归，得回归方程见表1。

表1 4种成分的线性回归方程

2.2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样，连续进样5次，记录4种酚酸的峰面积，计算RSD(%)值，结果RSD(%)在0.075～0.390之间，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

分别精密吸取同一炒苍耳子供试品溶液1 μL，按“2.2.1”项方法分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，记录4种酚酸的峰面积，计算RSD(%)值，结果RSD(%)在0.110～0.630之间，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.2.7 重复性试验

取同一炒苍耳子5份，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，精密吸取1 μL。样品在“2.2.1”项色谱条件下进样，记录4种酚酸的峰面积，计算其含量，计算得其RSD(%)值0.032～0.095之间，表明该样品处理方法具有良好的重复性。

2.2.8 加样回收率试验

按“2.1”项制备方法，制备炒苍耳子，取已知含量的炒苍耳子6份，按照“2.2.3”项下制备样品溶液6份，每份取0.5 mL，分别加入样品中成分含量接近的对照品，混合均匀，用0.2 μm滤膜过滤，按“2.2.1”项方法进样，结果4种成分的平均加样回收率在95%～105%之间，RSD(%)在0.100～0.300之间。

2.2.9 蛋白质含量测定

根据单因素试验结果，苍耳子蛋白质最佳提取条件如下，液料比∶粉末∶蒸馏水=1∶1∶2；提取pH=10；提取温度：90 ℃；提取时间：50 min。

取苍耳子粉末3 g，80 ℃水浴温度下，用石油醚对其进行脱脂处理4 h，粉末晾干备用。取上述粉末0.5 g，按液料比为12，加6 mL纯水溶解，用1 mol/LNaOH溶液调溶液pH值为10，50 ℃超声提取90 min，采用碱提法提取蛋白。

提取后样品取上清液，6 000 r/min,离心15 min，再次取上清，稀释100倍后，根据对照品牛血清蛋白浓度成梯度绘制得标准曲线，用BCA法测定蛋白质562 nm下吸光度值，进而得样品蛋白质含量。

各单因素试验结果及标准牛血清蛋白标准曲线见图2～6。

2.3 数据处理与分析

2.4 正交试验设计

以炒制温度(A)和炒制时间(B)为考察因素，每个因素选择4个水平，以苍耳子4种成分和蛋白质含量为综合评分指标。采用多指标正交试验法，优化苍耳子炒制工艺，因素水平表见表2。

表2 因素水平表

2.5 正交试验结果

按照正交表进行正交试验，按照“2.2.3”项下制备供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进样，得出4种酚酸峰面积及含量。按照“2.3”项下方法计算苍耳子各成分的综合评分值。采用综合加权评分法，优化苍耳子炒制工艺。正交试验结果见表3。

表3 试验设计与结果

从表3结果可见，通过综合评分法，温度因素的极差很大，时间因素极差相对较小。根据正交试验的结果，确定苍耳子的最佳炒制工艺为炒制温度150 ℃，炒制时间8 min。

2.6 验证试验

根据优选出的苍耳子炒制工艺制备3组炒苍耳子。对每组样品4种指标成分和蛋白质含量进行测定，将各成分含量计算平均值后，与生品含量做对比，与生品变化率情况，结果如表4所示。

表4 最佳工艺结果验证

3 讨论

实验考察了色谱柱、柱温、波长、进样量、流速和流动相等对色谱峰分离度的影响，色谱柱为Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)波长为327 nm，柱温为30 ℃，进样量为1 μL，流速为0.25 mL/min，流动相为0.1%磷酸-乙腈。此条件下，图谱基线平稳，分离度好。本实验选择的检测方法可靠稳定。

苍耳子属解表中药，其味甘，性温，归肺经，善发汗，上通脑顶，下行足膝，外达皮肤，可发散风寒、祛风湿、止痛、通鼻窍，是历代治疗鼻渊头痛之要药[10]。常用于治疗风湿性关节炎、急慢性鼻炎、过敏性鼻炎、皮肤病等免疫系统异常相关疾病，具有较高的药用价值。此外，毒理学研究表明，苍耳子具有肝脏、肾脏、心脏、胃肠道毒性等不良反应,尤其是肝损伤[11]后会出现黄疸和因心损伤后会出现心律不齐等症状[12],其毒性作用机制现在认为主要与其含有的蛋白质类成分密切相关。作为一味毒效并存的中药，苍耳子因使用不当也易引起一系列安全问题。

经现代研究表明，适当加热能提高苍耳子中绿原酸的含量[13]，陈健明等[14]研究表明苍耳子炮制去刺有助于提升镇痛作用，临床常通过炮制降低其毒性[15]。更多还原本实验研究表明，苍耳子炒制后，有效成分含量有所升高，毒性蛋白含量降低。在此基础上，本实验以苍耳子炒制温度及炒制时间为考察因素，4种酚酸有效成分及蛋白质含量为评价指标，通过正交试验，优选出苍耳子最佳炮制工艺为150 ℃，炒制8 min。同时对工艺进行验证，得到3组验证试验结果较生品含量比较变化率，得出结论，炮制品含量较生品而言，绿原酸含量上升50.121%；隐绿原酸含量上升7.817%；3，4-二咖啡酰奎宁酸含量下降57.237%；4，5-二咖啡酰奎宁酸含量上升126.996%；蛋白质含量较生品下降11.552%。结果表明，苍耳子炮制后酚酸类有效成分含量较生品整体上升，部分成分含量下降，可能与加热后酚酸类结构变化情况有关，因此“增效”现象还存在不足之处；毒性蛋白含量较生品降低。

毒性蛋白提取分离方法有待改进，以毒性蛋白指标作为其“减毒”的论点较为单一，可结合苍术苷、羧基苍术苷等其他毒性成分做进一步研究。此外，本实验仅仅从含量变化入手，还需要结合药效实验做更深入的探讨，以得出苍耳子炮制“减毒增效”的确切作用机制。