针灸拮抗CTX荷瘤小鼠骨髓细胞中jag1、Notch2和numb1/2 mRNA的作用机制研究

庄语,于冬冬,*,程相琨,范世东,刘玉璐,马田田,王永欣,王文哲

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008；3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450001)

环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)作为常用广谱类抗肿瘤药[1]，其治疗恶性肿瘤的同时也会导致许多毒副作用，特别是抑制骨髓造血功效，造成白细胞下降，机体自身免疫下降[2-3]。前期课题组的研究结果证实，针灸能够通过调节骨髓细胞DNA修缮，有效抑制过度激活的Notch信号通路，促使白细胞归巢，修复造血微环境的损害等方面来改善化疗造成的骨髓抑制[4-7]，本课题采用RT-PCR技术在前期筛选出的Notch传导路径上关键基因jag1、Notch2、numb1、numb2为切入点[8]。观察针灸对其mRNA的干预，探究讨论其改善CTX化疗所引发骨髓抑制的机理。选取荷瘤模型小鼠，旨在使荷瘤小鼠体质无限贴合肿瘤病患，为临床上针灸诊治恶性肿瘤化疗所致骨髓抑制提供相关有效研究根据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级KM种雄性健康小鼠，采购于郑州大学动物研究中心，批号：SCXK(豫)2010-0002，体质量(18.0±2.0)g。在河南中医药大学动物研究所饲养，温度：20～25 ℃，相对湿度：50%～70%，3 d后植瘤。

1.2 试剂

环磷酰胺(山西普德，批号：04120501)；氯化钠溶液(250 mL/瓶，山东鲁抗辰欣药业，批号：120412107)；Trizol：invitrogen (货号：15596-026)；DEPC处理水(货号：BYL40387)；氯仿、异丙醇 HPLC级；无水乙醇 AR级；SYBRGreen PCR试剂盒(Thermo货号：F-415X)L，逆转录试剂盒(Thermo货号：#K1622)。

1.3 仪器

实验用艾灸条(规格:0.4 cm×25 cm，河南南阳卧龙艾绒厂)；美容毫针(规格:0.19 cm×10 mm，苏州医疗用品有限公司)；光学显微镜；一次性微量采血管；白细胞计数板；恒温器(型号：K10CD)；旋涡振荡器(型号：XW-80A)；冷藏冰箱(型号：BDC-280e)；离心机(Sigma)；Real-time检测仪(7500Sequence Detection System，型号：ABI-7500型，美国)等。

1.4 模型制作方法

依据课题组的预建模方法进行[9]。将肿瘤细胞5×106/0.2 mL植入40只小鼠的左腋窝中，7 d后，共选择32只WBC计数值正常且符合试验标准的荷瘤小鼠,(22±2)g、瘤块半径0.4 cm左右,分成4组，每组8只，染色编号。荷瘤空白对照组腹腔注入等量0.9%Nacl溶液，其余3组均一次性腹腔注射同等浓度150 mg/kg的CTX。遵照CTX药代动力学过程，停药4 h后造模顺利达成[10]。

1.5 干预方法

针疗干预组于造模成功24 h后实施针刺干预，选穴定位参照《实验针灸学》[11]选“大椎”以及双侧“膈俞”“肾俞”“足三里”，直刺3 mm，留针6 min，1次/d，共5 d。灸疗干预组于造模成功24 h后实施艾灸干预，选穴同上，将细艾条距局部穴位皮肤2 cm处悬灸3 min，两穴为1组，共悬灸6 min，1次/d，共5 d。荷瘤空白组和CTX模型组给予同干预组相同抓取及固定方法，不进行任何干预。

1.6 取材方法

各组小鼠于植瘤7 d后施尾部静脉采血，根据编号依次加入390 μL 3%冰乙酸稀释液，连续6 d，用于白细胞计数测量；治疗结束后，禁食不禁水1 d，第6天开始对所需标本解剖取材。各组小鼠依次置于消毒实验台上，进行颈椎脱臼处理，操作者在干冰上取小鼠同侧的肱骨和股骨，剔净骨头附着组织，置于装有0.9% Nacl溶液烧杯中清洗干净后，于-80 ℃低温冰箱中快速储存，用于荧光定量PCR。

1.7 观察指标及检测方法

小鼠一般情况观察：对比观察每组小鼠在整个实验过程的体质量、饮水进食、精神状态、毛发色泽、二便和活动等情况。

外周血白细胞计数：取标本血样，充分摇匀后用玻璃棒依次将溶解均匀的血液稀释液从盖玻片旁滴入白细胞计数板，在光学显微镜下进行观察并记录白细胞计数板上4个象限的白细胞数，根据公式计算最终数据。

荧光定量PCR法检测肱、股骨组织jag1、Notch2、numb1、numb2 mRNA 的表达,取-80 ℃保存的标本，用Trizol提取总RNA，将所提取RNA逆转录成cDNA，将制备好的cDNA进行PCR扩增，反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40个循环。以GAPDH为内参，用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠一般状况比较

荷瘤空白组小鼠体质量无明显改变，饮水进食量正常，精神良好，毛色鲜亮有泽、触摸顺滑，二便正常及活动正常；CTX模型组小鼠体质量下降，饮水进食量减少，精神萎靡，毛发少光泽且部分小鼠伴有毛发脱落，大便溏，小便量减少，活动力下降且伴有扎堆表现；与CTX模型组比，其余两组小鼠上述状态均显著缓解。

2.2 各组小鼠外周血白细胞计数比较

与荷瘤空白组比，各组小鼠白细胞计数从注射CTX后第1天至第3天持续下降，且在第3天降至最低(P<0.05)；与CTX模型组比，从第4天开始，针疗干预组和灸疗干预组白细胞回升速度明显高于CTX模型组；与针疗干预组比，灸疗干预组白细胞水平差异无统计学意义，见表2。

表2 各组小鼠外周血白细胞计数的变化

2.3 各组小鼠肱、股骨组织jag1、notch2、numb1、numb2 mRNA表达比较

与荷瘤空白组比较，CTX模型组小鼠肱、股骨组织jag1、notch2 mRNA表达均升高，numb1 mRNA表达降低，但差异无统计学意义，numb2 mRNA表达降低(P<0.05)；与CTX模型组比较，针疗干预组与灸疗干预组小鼠肱、股骨组织jag1、notch2 mRNA表达均降低，针疗干预组numb1 mRNA表达降低，灸疗干预组numb1 mRNA表达升高，结果差异无统计学意义，灸疗干预组numb2 mRNA表达升高(P<0.05)；与针疗干预组比，灸疗干预组小鼠肱、股骨组织jag1、notch2、numb1、numb2 mRNA表达差异无统计学意义，见表3。

表3 各组小鼠肱、股骨组织jag1、notch2、numb1、numb2 mRNA表达比较

3 讨论

化疗作为全世界公认的治疗恶性肿瘤的关键常规措施，然骨髓抑制则是恶性肿瘤化疗后临床上多见的毒副反应，其中以外周血白细胞生成障碍且降低为主[12]。临床多见倦态乏力，唇白神疲，纳差汗多，气短健忘，舌淡脉弱等相关虚损症状，中医多称之为“虚劳”“血虚”等。《伤寒论》认为“虚劳”治宜温养脾肾，扶正祛邪。对症状的改善是中医治疗的优势[13]，课题组经过近40年临床与实验研究筛选出一组改善骨髓抑制的有效组穴：大椎，膈俞，肾俞，足三里。大椎为阳经交汇之处，与督脉交于后项部，可祛邪外出，激发阳气，恢复正气；膈俞，乃八会穴之血会，《医学入门》：“膈俞……主一切血疾”；肾俞固本培元，益髓填精，激发脏腑原气；足三里，胃腑下合穴，《流注指要赋》言：“三里却五劳之羸瘦”。诸穴配伍精妙，穴精效显，使获补脾益肾、益气活血、扶正祛邪之成。

Notch路径遍布于动物组织以及器官中，Notch路径的正常传输对新陈代谢自我更新以及细胞增殖、分化和凋亡等多种有机体活动中扮演关键职能[14]，还对造血干细胞的增殖分化有一定的调节作用[15]，国内外大量研究表明Notch路径与肿瘤化疗所致骨髓抑制息息相关。VARNUM-FINNEY等[16]发现Notch路径通过对其受体notch2和配体之一jagged1的干预，使得化疗后小鼠重度骨髓抑制情况改善，并恢复其造血能力。由此表明，notch2和jagged1作为Notch路径上的重要因子不仅能调节造血功能还对恶性肿瘤化疗后所致骨髓抑制扮演关键调控角色。Numb在唾液腺肿瘤、乳腺癌、膀胱癌以及食管癌等多种肿瘤组织结构中表现出水准差异的转录翻译过程[17]。有研究发现Numb不仅对细胞命运起支配性作用，同时主导Notch信号通路的逆反馈调节，二者之间的平衡能确定细胞分化的方向，Numb还可通过自身PTB结构域与Notch路径胞内结构域及C端序列的结合相互影响，拮抗Notch的生理学功能[18]。Numb同时干预Notch到细胞内的传送途径，进而下调Notch信号传导。研究发现[19]，Numb引起Notch或NICD的内吞，并分离出Notch的整个长度或部分长度，从而达到抑制Notch信号传导途径的目的。亦有研究揭示Numb凭借阻止Notch路径上相关基因兴奋发挥抑癌功效，抑制肿瘤的发生发展[20]。由此可表明，Notch路径上的关键信息基因是针灸改善或缓解CTX化疗所致骨髓抑制的重要路径。

本次研究结果从小鼠一般状况、白细胞计数以及基因3个层面得知，除荷瘤空白组外，其余3组小鼠注射CTX后，由于CTX其严重的毒副作用导致每组小鼠一般状况较差，白细胞计数下降以及每组小鼠骨髓细胞中Notch路径上的关键差异基因numb1、numb2 mRNA低表达，基因notch2、jag1 mRNA高表达，致 Notch路径居于异常极度启动的状况，不但引起骨髓造血干/祖细胞增殖功能削弱，还矛盾地使它们分化，以致造血干/祖细胞的数目大为降低，降低了骨髓造血功能，更干扰细胞正常运行，引起骨髓抑制，进一步抑制Notch信号路径，降低该造血重建能力。治疗组分别施以针疗与灸疗后，小鼠一般情况得到缓解，白细胞计数大幅度提升且在治疗第5天几乎与基础白细胞水平持平，Notch路径上关键差异基因转录情况得到调节，从而抑制了异常过度激活的Notch路径。由此可见针灸可以凭借对Notch路径关键差异基因的调控来减弱因环磷酰胺化疗引起的骨髓抑制，从基因转录的角度说明了Notch信号通路是针灸缓解化疗后骨髓抑制，提升WBC的重要路径。本次选用S180植瘤小鼠，体质更贴合临床肿瘤病患，为临床诊治提供了科学的实验基础。