尖叶假龙胆配伍扯根菜对酒精性肝损伤模型大鼠炎症因子及氧化应激的影响

卜义凡，朴圣爱，丁一，郭钟秀，胡晓阳*

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

酒精性肝损伤(ALD)是由于过量摄入酒精导致的与肝脏相关的各种疾病的总称，虽然ALD各个阶段病变特征已非常明确，但其复杂的病理生理学过程至今尚未被明确阐述，目前学界主要认为其与过量摄入乙醇所引起的氧化应激、炎症反应、脂代谢障碍、线粒体功能障碍、内毒素等多因素有关，其中氧化应激和炎症反应损伤在ALD的发生发展过程中扮演了重要角色。相关炎症因子导致肝细胞炎症反应，损伤肝细胞，机体氧化与抗氧化作用之间的平衡，造成过氧化病理状态，可能是引发ALD的重要原因[1-2]。目前对本病的治疗方法较为局限，一般为戒酒和对症治疗，晚期主要为肝移植。尖叶假龙胆是传统蒙药，其味苦、性凉，能清热解毒、利胆退黄，常用来治疗黄疸、肝炎等疾病，现代药理学研究表明其有保肝、抗肿瘤、抗心律失常、抗炎和抗氧化等作用[3]，本课题组也已在前期研究中[4-5]证实了尖叶假龙胆对ALD的治疗作用。扯根菜属于传统苗药，其性温，味甘，有利尿消肿、清热解毒、平肝健脾、活血、祛黄疸等作用，现代研究表明扯根菜及其提取物具有抗炎、抗氧化和解酒护肝等效果[6-9]。目前关于将传统蒙药尖叶假龙胆和传统苗药扯根菜配伍应用于ALD治疗的相关研究较少，且前期研究[10]已证实两药配伍对ALD的治疗作用，因此本研究观察两药配伍对ALD大鼠炎症因子和氧化应激的影响，进一步明确其对ALD的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠80只，体质量180～220 g，购自黑龙江中医药大学动物实验中心，许可证编号：SCXK(黑)2018-001。实验动物饲养于黑龙江中医药大学方剂学实验室，实验经黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会批准后进行。

1.2 实验药物

尖叶假龙胆(保存于黑龙江中医药大学的方剂学实验室，购自黑龙江省大兴安岭地区，经黑龙江中医药大学樊锐峰教授鉴定为龙胆科假龙胆属的尖叶假龙胆植物的干燥全草)；扯根菜(购自河北省安国药材市场，经黑龙江中医药大学樊锐峰教授鉴定为虎耳草科扯根菜属植物扯根菜的干燥全草)；复方蛋氨酸胆碱片(吉林通化东宝药业股份有限公司)。

1.3 主要仪器与试剂

电子分析天平(AL-204，梅特勒-托利多仪器有限公司)；旋转蒸发仪(RE52CS-1，上海亚荣生化仪器厂)；超薄切片机(2135，德国徕卡公司)；显微影像成像系统(Moticam3000，麦克奥迪实业公司)；全自动生化分析仪(Glamour 2000，美国M.D公司)；台式离心机(Mikro22/22R，德国艾本德股份有限公司)；恒温水浴锅(B-260，上海亚荣生化仪器厂)。

56°红星二锅头(北京红星股份有限公司)；生理盐水(哈尔滨三联药业股份有限公司)；乌拉坦(上海山浦化工有限公司)；福尔马林(天津市致远化学试剂有限公司)；二甲苯(北京化工厂)；乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒、乙醛脱氢酶(ALDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、血红素氧合酶-1(HO-1)试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒、大鼠转化生长因子β(TGF-β)ELISA检测试剂盒、大鼠白细胞介素1(IL-1)ELISA检测试剂盒、大鼠白细胞介素6(IL-6)ELISA检测试剂盒、大鼠髓样分化因子88(MyD88)ELISA检测试剂盒(湖南永和阳光科技有限责任公司)。

1.4 药液制备

按照大鼠的体质量、给药时间和人鼠体质量比例计算出所需生药总量为336 g，按照尖叶假龙胆336 g，扯根菜336 g，尖叶假龙胆与扯根菜各168 g(1∶1)，尖叶假龙胆112 g和扯根菜224 g(1∶2)，尖叶假龙胆224 g和扯根菜112 g(2∶1)配制相应比例药物。蒸馏水浸泡0.5 h，随后用加热回流提取法提取2 h，滤出药渣，得到第1次煎液。再次在药渣中加入蒸馏水，加热回流提取2 h，滤出药渣，得到2次煎液。将两次煎液混匀，用旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩，加蒸馏水配制成浓度为0.5 g/mL(生药量/mL)的药液。阳性对照药物选用复方蛋氨酸胆碱片，将复方蛋氨酸胆碱片粉碎，用蒸馏水将其稀释成0.04 g/mL的溶液。

1.5 造模与分组

大鼠适应性喂养7 d，然后随机分为空白组、模型组、阳性药组、尖叶假龙胆与扯根菜1∶1配伍组(以下简称1∶1组)，尖叶假龙胆与扯根菜1∶2配伍组(以下简称1∶2组)，尖叶假龙胆与扯根菜2∶1配伍组(以下简称2∶1组)共8组，每组10只。本实验模拟人类饮酒习惯，采取梯度酒精灌胃配合高脂饲料喂养造模。实验第1周，除空白组外，各组大鼠以7 mL/kg灌胃56°红星二锅头，空白组予以同体积生理盐水灌胃。第2周开始，灌胃的酒精量每周递增1 mL/kg，至第8周达到14 mL/kg，空白组大鼠则全程给予相应体积的生理盐水进行灌胃。同时空白组大鼠予以普通饲料喂养，其余各组高脂饲料喂养。过程中，尖叶假龙胆组死亡1只，模型组、1∶1组、1∶2组及2∶1组分别死亡3只。

1.6 给药方法

实验第5周至第8周除空白组和模型组外，其余各组均通过灌胃法给予实验大鼠相应的药物。为了模拟人类饮酒和用药的过程，并为大鼠消化吸收留出相应的时间，每日给药与酒精灌胃错时6 h，即采取于上午给予酒精灌胃而下午(间隔6 h)给予药物灌胃的方法，空白组和模型组给予同体积生理盐水灌胃。具体方法为：阳性药组给予浓度为0.04 g/mL的复方蛋氨酸胆碱稀释液10 mL/kg灌胃；尖叶假龙胆组、扯根菜组、1∶1组、1∶2组及2∶1组均以10 mL/kg药量给予相应药物灌胃，各实验组给药量相当于生药材5 g/kg。空白组和模型组给予同体积的10 mL/kg生理盐水灌胃。

1.7 样本采集与指标检测

1.7.1 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠炎症因子的影响

末次给药6 h后禁食水，12 h后腹腔注射20%浓度的乌拉坦溶液(0.5 mL/100 g)麻醉，大鼠进入麻醉状态后腹主动脉采血，血液静置10 min后置于离心机配平，在4 ℃ 3 000 r/min条件下离心10 min，用移液器取上层血清，按照试剂盒说明书操作，测定血清中TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6和MyD88的含量。

1.7.2 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠氧化应激的影响

末次给药6 h后禁食水，12 h后腹腔注射20%浓度的乌拉坦溶液(0.5 mL/100 g)麻醉，大鼠进入麻醉状态后取出完整肝脏，在肝脏大致相同部位剪取约1 g肝组织，置于加入9 g生理盐水的匀浆器中，将匀浆器置于冰水混合物中充分研磨得到10%的肝组织匀浆液。将肝组织匀浆液在4 ℃，3 500 r/min条件下离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书操作，测定肝组织中MDA、SOD、ADH、ALDH和HO-1含量。

1.7.3 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠肝组织形态的影响

选择每只大鼠肝右叶大致相同部位进行取材，切成3 mm3左右的肝脏组织切块，将切取的肝脏组织放置在事先准备好的装有福尔马林溶液的冻存管中进行固定，固定时间约7 d。之后逐级进行酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、片厚6 μm，进行HE染色后，使用光学显微镜对肝脏的组织形态进行观察。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠炎症因子的影响

如表1所示，与空白组相比，模型组各炎症因子水平显著增高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，阳性药组各指标变化,差异有统计学意义(P<0.01)；尖叶假龙胆组TGF-β、IL-1含量降低(P<0.01，P<0.05)，其余指标变化差异无统计学意义(P>0.05)；扯根菜组TGF-β、TNF-α、IL-1、IL-6和MyD88含量降低,差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；尖叶假龙胆与扯根菜1∶1配伍组TGF-β、TNF-α、IL-1和MyD88含量降低差异有统计学意义(P<0.01)，IL-6含量变化差异无统计学意义(P>0.05)；尖叶假龙胆与扯根菜1∶2配伍组TGF-β水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，其余指标变化无统计学意义(P>0.05)；尖叶假龙胆与扯根菜2∶1组TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6和MyD88水平降低,差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

表1 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠炎症因子的影响

2.2 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠氧化应激的影响

如表2所示，与空白组相比，模型组MDA含量升高，SOD、ADH、ALDH和HO-1含量降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，阳性药组各指标变化差异有统计学意义(P<0.01)；尖叶假龙胆组ADH和HO-1含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)，其余指标变化差异无统计学意义(P>0.05)；扯根菜组SOD和HO-1含量升高(P<0.01)，MDA含量降低、ADH含量升高(P<0.05)，ALDH含量变化差异有统计学意义(P>0.05)；尖叶假龙胆与扯根菜1∶1组SOD和ADH含量升高(P<0.01)，MDA含量降低、HO-1含量升高(P<0.05)，ALDH含量变化差异无统计学意义(P>0.05)；尖叶假龙胆与扯根菜1∶2组ADH和HO-1含量升高(P<0.05)，其余指标变化差异无统计学意义(P>0.05)；尖叶假龙胆与扯根菜2∶1组SOD和ALDH含量上升(P<0.01)，MDA含量下降、ADH和HO-1含量上升(P<0.05)。

表2 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠氧化应激的影响

2.3 尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD模型大鼠肝组织形态的影响

空白组大鼠的肝脏组织在光镜下可见肝小叶结构清晰完整，肝细胞索状排列，围绕中央静脉以辐射状排列，没有炎性细胞浸润；细胞间隙均匀，界限清晰，细胞大小基本一致，呈多面体形，细胞核大而圆且居中，细胞内未发现明显腔泡；肝索间可见规律分布的肝窦，未发现纤维组织增生。

模型组大鼠的肝脏组织可见多个肝小叶结构破坏，肝索排列杂乱无章，肝窦间隙增大；肝细胞间隙不均，核型不整，胞质浅染，可见水样、气球样变性，可观察到大量炎性细胞浸润和大小不等的空泡，部分肝细胞坏死。

阳性药组大鼠肝组织内肝小叶结构比较完整，肝细胞围绕中央静脉放射状排列较清晰，仅部分肝小叶内见肝索排列紊乱；部分肝细胞肿胀，核质淡染，偶见水样变性，可见少量炎细胞浸润，几乎未见空泡。

尖叶假龙胆组大鼠肝组织可见肝小叶结构不完整，肝索排列杂乱，部分可见纤维组织增生；扯根菜组大鼠肝组织中肝小叶较完整，肝索排列相对较整齐，部分肝细胞肿胀，核质淡染。

尖叶假龙胆与扯根菜1∶1配伍组、1∶2配伍组、2∶1配伍组3组的肝组织内肝小叶结构比较完整，肝索排列较清晰，部分肝小叶内见肝索排列结构紊乱；肝细胞间隙较均匀，核型相对较完整，偶见炎症反应，有疑似纤维组织增生。尖叶假龙胆与扯根菜1∶1配伍组和2∶1配伍组肝组织整体状况相对较好，纤维化程度更轻微。见图1。

3 讨论

中医学认为，蒙药尖叶假龙胆具有清热解毒、利胆退黄等功效，临床中常用于治疗黄疸、肝炎等病；现代研究表明，尖叶假龙胆主要化学成分为酮类化合物、萜类化合物、木脂素类化合物、黄酮类化合物和甾体类化合物，具有保肝、抗炎、抗氧化、抗心律失常、抗心肌缺血、抗肿瘤、降糖等药理作用[11]，并且前期研究已证实尖叶假龙胆水煎液能通过降低转氨酶、调节脂代谢系统、减少氧化损伤等途径发挥对ALD的保护作用[4-5]；传统苗药扯根菜有利尿消肿、清热解毒、平肝健脾、活血、祛黄疸等作用，现代研究扯根菜主要化学成分为黄酮类、萜类、多酚类、木质素类以及有机酸类等，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、解酒护肝等药理作用[6-9]，以其为主要成分的成药肝苏颗粒，已被广泛临床应用。两药相配伍是取七情配伍中“相须为用”的配伍方法，两药都有清热解毒、护肝、利胆退黄之功，配伍以增利湿退黄之效，尤适用于防治ALD。因此本研究具有充分的中医学理论依据和药理学研究基础。目前鲜有将苗药与蒙药相结合配伍治疗ALD的研究，课题组在前期研究中已证实两药配伍对ALD的保护作用，但对其配伍后的治疗机制仍处于盲区，因此本研究以炎症因子和氧化应激为切入点，着重探索两药配伍对ALD的保护作用机制，实验结果显示，两药配伍能降低炎症因子水平，调节氧化应激反应，显著改善肝组织病理形态，尤以尖叶假龙胆与扯根菜2∶1比例配伍效果最佳。

炎症反应在ALD发生发展过程中扮演重要角色。乙醇增加肠黏膜的通透性，使肠源性内毒素(LPS)更易从肠腔进入门脉循环。LPS可以活化Kupffer细胞和肝星状细胞。被激活的肝Kupffer细胞和肝星状细胞能依赖MyD88信号途径，诱导上调细胞内核因子-кB(NF-кB)等相关转录因子的表达，而其下游的TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6等炎性细胞因子的表达随之上调[12]。适量TNF-α可以在肝脏受损后刺激正常肝细胞的增殖，促进肝细胞的再生，过量则可诱导肝细胞损伤和凋亡。乙醇可以刺激单核细胞和巨噬细胞产生过量TNF-α导致肝损伤。与其相似的是，适量的IL-1和IL-6能促进肝细胞再生，减轻炎症反应，而在酒精刺激下，过量的IL-1会刺激成纤维细胞上的IL-1受体(IL-1r)，致使成纤维细胞发生变性、沉积形成肝纤维化；IL-6则直接刺激肝脏中的成纤维细胞、贮脂细胞、Kupffer细胞等分泌细胞因子，导致肝脏组织发生炎症反应、脂肪堆积和纤维化[13-14]。TGF-β是导致肝纤维化的重要因素,同时也参与诱导肝细胞凋亡[15]。MyD88是多种信号通路传导过程中的衔接蛋白，能够介导多数Toll样受体(TLRs)导致炎症反应[16]。有研究认为，TLR4-MyD88-NF-κB信号通路与肝损伤密切相关，MyD88负责承接TLR4活化信号，能够介导TNF-α、IL-1和IL-6等细胞信号的传导进而导致ALD的发生[17]。结合本研究结果来看，尖叶假龙胆与扯根菜配伍能降低TNF-α、TGF-β、IL-1、IL-6和MyD88水平，可能是通过MyD88途径介导的细胞信号通路，影响TNF-α、TGF-β、IL-1和IL-6的表达，从而减轻炎症反应，减缓ALD发生发展进程。

MDA的产生源于自由基作用于脂质的过程，并能损伤细胞，因此MDA含量是氧化应激机制中抗氧化系统的重要检测指标，能够反映出机体抗氧化作用的潜在能力、脂质过氧化的速率及损伤程度。长期大量梯度浓度酒精灌胃模型大鼠导致大鼠体内氧化与抗氧化作用失去平衡，肝组织中丙二醛活性增强。酒精性肝损伤患者饮酒过量，会导致抗氧化物质的含量下降，引起肝细胞中SOD含量降低不能有效清除自由基，使其蓄积于肝脏中，最终导致细胞膜脂质的过氧化反应，损伤肝细胞。肝脏对于酒精的代谢主要在ADH系统和ALDH系统参与下完成，ADH和ALDH含量降低，使乙醇代谢和乙醛代谢速率下降，导致乙醛堆积并产生乙醛蛋白加合物(APA)导致肝损伤[18]。HO-1参与肝细胞对抗氧化应激反应的过程并在其中发挥着重要作用。HO-1能将血红素转化为胆绿素，同时生成一氧化碳和游离铁，以此对抗肝细胞中的氧化应激反应，保护机体组织器官免受损害[19]。结合本研究结果来看，尖叶假龙胆与扯根菜配伍降低了肝组织MDA含量，提高了SOD、ADH、ALDH和HO-1含量，可能是通过提高抗氧化物水平，降低氧化产物水平，从而调节氧化应激，改善肝损伤。

综上所述，尖叶假龙胆配伍扯根菜对ALD的保护作用机制可能是通过调节MyD88途径介导的细胞信号通路进而影响血清炎症因子水平，减轻炎症反应；并通过降低氧化产物水平，提高抗氧化物水平，减轻氧化应激损伤，进而发挥改善ALD的作用，并且尤以两药2∶1比例配伍效果最佳。