二氢杨梅素抑制黄曲霉菌生长的机制

李 倩，赵 颖，乔苏瑞，谢岩黎

（河南工业大学粮油食品学院，河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，河南 郑州 450001）

黄曲霉菌（，AF）属子囊菌门、丛梗孢科、曲霉属，是一种常见的腐生型好氧真菌。AF易侵染多种粮食作物，如小麦、玉米、花生，不仅损害其品质，而且影响经济效益。据报道，我国每年因霉菌污染而造成的粮食损失高达2 100万 t，占全国粮食总产量的4.2%，是每年新增粮食产量的4 倍多。作为一种病原性真菌，AF极易通过呼吸道、口耳眼鼻、皮肤等部位进入人和动物体内，引起支气管炎、肺泡坏死、外耳炎、角膜炎、鼻窦炎等多种疾病，危害人畜身体健康。此外，AF可产生多种次级代谢产物——黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT），其中黄曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）毒性最强，约为氰化钾的10 倍、砒霜的8 倍、二甲基亚硝胺的75 倍、三聚氰胺的416 倍，被世界卫生组织（World Health Organization，WTO）列为I类致癌物。AFT对光、热、酸较稳定，280 ℃高温下才可裂解，因此一般烹调加工温度难以破坏。

二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）又名白蔹素、蛇葡萄素，属于二氢黄酮类化合物，多存在于葡萄科、杨梅科、杜鹃科、藤黄科、大戟科及柳科等植物中，其中在葡萄科藤茶中含量最高。以往研究表明，DMY具有广泛的生物活性，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节血糖血脂、保肝护肝等，因此广泛应用于药品、食品、化妆品等行业。例如，目前以DMY为功效添加成分已研制出速溶茶、显齿蛇葡萄总黄酮含片、DMY解酒保肝胶囊等保健食品。除此之外，DMY可以有效抑制食源性细菌，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、副伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌，DMY对其最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）分别为0.63、1.25、0.31、0.63、0.31 mg/mL。在熊皓平等的研究中，DMY对AF、青霉、黑曲霉、毛霉、根霉等真菌也具有显著抑制效果。

作为一种天然植物提取物，DMY成本低廉、来源广泛，具有极大的开发前景。本实验首先检测DMY对AF的抗真菌活性，在此基础上通过测定细胞壁/膜完整性、细胞内容物释放量、呼吸速率、细胞外相对电导率和pH值探究DMY潜在的抗真菌机制，最后评估其在粮食中的抑菌效果，以期为天然抑菌剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

AF菌株（CGMCC 3.6304） 中国微生物菌种保藏中心（China General Microbial Culture Collection Center，CGMCC）；DMY（纯度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；卡尔科弗卢尔荧光增白剂（calcofluor white，CW） 上海懋康生物科技有限公司；抗荧光猝灭剂上海生工生物工程股份有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI） 北京索莱宝科技有限公司；花生、玉米购于郑州永辉超市。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；101-E电热鼓风干燥箱 北京市光明医疗仪器厂；SW-CJ-2D双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；PYX-DHS-40X50-BS隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂；THZ-98B双功能汽浴恒温振荡器上海诵诚实业发展有限公司；BM-37XBC倒置生物显微镜上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；DFC 7000T荧光显微镜德国徕卡公司；UV-6100S紫外-可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司；DZS-706-C多参数分析仪上海雷磁仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DMY对AF抑制作用实验

AF于（28±2）℃下在固体沙氏培养基（Sabouraud dextrose agar，SDA）（含40 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨和20 g/L琼脂）上培养7 d，然后用打孔器在菌落中央打孔制得AF菌饼（直径0.6 cm）备用。

孢子悬浮液制备：向AF的SDA表面倾注5 mL生理盐水并用涂布器刮取孢子，吸取含有孢子的生理盐水并用滤纸过滤，所得滤液即为孢子原液。充分吹打混匀后用血球计数板计数，加入液体沙氏培养基（Sabouraud dextrose broth，SDB）（含40 g/L葡萄糖和10 g/L蛋白胨）稀释孢子悬浮液使孢子浓度为5×10个/mL，备用。

用无水乙醇配制不同质量浓度的DMY溶液，避光储存于4 ℃冰箱。实验所用水均为去离子水。

1.3.1.1 DMY对AF孢子萌发抑制率的测定

DMY对AF孢子萌发抑制率的测定参考文献[16]的方法并稍作修改。在96 孔板加入20 μL孢子悬浮液（5×10个/mL）和20 μL DMY溶液（终质量浓度分别为0（对照，后同）、0.5、1、2、4、8、16 mg/mL）。将96 孔板置于恒温培养箱（28±2）℃中孵育48 h，每24 h于倒置显微镜下观察孢子萌发形态，显微镜拍照后计算孢子萌发抑制率（视野中未萌发孢子数占总孢子数比值），DMY对AF孢子的最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）指DMY完全抑制孢子萌发的最小质量浓度。

1.3.1.2 DMY对AF菌丝生长抑制率的测定

在培养皿（直径6 cm）中加入10 mL含DMY（质量浓度分别为0、2、4、8、16 mg/mL）的SDA。培养基凝固后，在培养基中央打孔（直径0.6 cm），然后嵌入AF菌饼，密封后于恒温培养箱静置72 h，每24 h测量菌落直径。72 h后菌落直径无变化且菌丝生长抑制率为100%的最小质量浓度即为DMY对AF菌丝的MIC。菌丝生长抑制率按式（1）计算。

式中：和分别代表对照组和实验组在SDA上的平均菌落直径/cm。

1.3.2 孢子活力检测和菌丝生物量分析

1.3.2.1 孢子活力检测

采用平板记数法检测孢子活力，结果以孢子存活率表征。参照1.3.1.1节方法，制备DMY终质量浓度分别为0、4、8、16 mg/mL的孢子悬浮液。然后取100 μL孢子悬浮液稀释10倍，取200 μL均匀涂布于9 cm培养皿（每个培养皿含30 mL SDA，每个质量浓度做3个重复），置于恒温培养箱48 h，根据菌落数按式（2）计算孢子存活率。

式中：为用于涂布的孢子数量；为培养48 h后记录的菌落数。

1.3.2.2 菌丝生物量分析

将100 μL孢子悬浮液（5×10个/mL）加入20 mL SDB中，于（28±2）℃、150 r/min振荡培养24 h，然后加入2 mL DMY溶液（终质量浓度分别为0、2、4 mg/mL），继续振荡培养一定时间后用滤纸过滤培养液收集菌丝，用去离子水冲洗两次以洗去培养液。0-24组代表培养24 h收集的菌丝，0-48、2-48、4-48组代表在48 h收集的DMY终质量浓度分别为0、2、4 mg/mL的菌丝。将各组收集的菌丝在80 ℃电热恒温干燥箱中干燥24 h后分别称质量，以表征菌丝生物量。

1.3.3 细胞壁完整性测定

将50 μL孢子悬浮液（5×10个/mL）加入10 mL SDB中，于恒温培养箱静置培养24 h。加入1 mL DMY溶液（终质量浓度分别为0、1/2 MIC和MIC）。再静置培养24 h，取菌丝或培养液进行细胞壁完整性、细胞膜完整性和细胞内容物释放量的分析与测定。

细胞壁完整性分析参考文献[17]的方法并稍作修改。取少量菌丝置于载玻片上，用10%（质量分数）KOH溶液和CW染色，并滴加抗荧光猝灭剂保护荧光，最后用荧光显微镜观察并拍照（放大20 倍）。

1.3.4 细胞膜完整性测定

参考文献[18]的方法进行染色。取少量1.3.3节培养的菌丝置于载玻片上，滴加10 μL PI染料（1 μL/mL）染色，避光静置20 min后，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）洗去未结合染料。滴加抗荧光猝灭剂并用荧光显微镜观察拍照，采用Image J软件计算PI荧光强度，以表征细胞膜完整性。

1.3.5 细胞内容物释放量的测定

细胞内容物释放量实验参考文献[19]的方法并稍作修改。取2 mL 1.3.3节培养液，5 000 r/min离心10 min，取上清液测定260 nm波长处光密度值（OD），测定时用新鲜的空白SDB校准。

1.3.6 相对电导率和pH值的测定

相对电导率和pH值的测量参考文献[20]。将500 μL孢子悬浮液（5×10个/mL）加入100 mL SDB中，（28±2）℃、150 r/min振荡培养24 h。加入10 mL DMY溶液（终质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC），然后再振荡培养24 h。收集0.5 g菌丝悬浮在 20 mL 纯水中，使用多参数分析仪测定0、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 min时混合液的电导率和pH值。检测完毕后立即煮沸5 min，冷却至室温后测定混合液的电导率。按式（3）计算相对电导率。

式中：和分别代表样品煮沸前后的电导率/（μS/cm）；和分别代表纯水煮沸前后的电导率/（μS/cm）。

1.3.7 呼吸抑制率的测定

DMY对AF孢子呼吸代谢影响的测定参考文献[21]。向试管中加入7.2 mL磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.0）和2 mL孢子悬浮液（5×10个/mL）静置5 min后，加入0.8 mL 1%（质量分数）葡萄糖，混合均匀后静置10 min，然后加入1 mL DMY溶液（终质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC）混匀后静置10 min，以等体积去离子水作为空白组。待溶液稳定后用溶解氧测定仪测定溶解氧浓度，30 min后再次测定培养液的溶解氧浓度，计算30 min内溶解氧浓度变化（＝-）。按式（4）计算呼吸抑制率。

式中：和分别代表空白组和DMY样品组在30 min内溶解氧浓度变化。

1.3.8 DMY对花生和玉米籽粒储存过程中AF的体外抑菌效果分析

DMY对花生和玉米籽粒储存过程中AF的抑制效果测定参考文献[22]的方法并稍加修改。花生和玉米籽粒用无菌水洗涤，然后用紫外线照射20 min。在超净工作台短暂干燥后，将10 粒花生均匀放入直径6 cm培养皿中。将400 μL孢子悬浮液（5×10个/mL）与40 μL DMY溶液混合（DMY终质量浓度分别为0、1/2 MIC和MIC），随后均匀涂抹于花生表面（40 μL/粒）。在恒温培养箱（28±2）℃中放置72 h，每24 h统计1 次受污染花生的数量并拍照。以相同方式测定DMY对玉米籽粒的抗真菌作用。按式（5）计算花生/玉米籽粒污染率。

式中：和分别代表72 h后花生/玉米籽粒的污染个数和实验所用花生/玉米籽粒总数。

1.4 数据处理与统计分析

每组实验重复至少3 次，采用Origin 2017软件处理数据，结果表示为平均值±标准差。采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，通过Duncan多重比较进行显著性分析，＜0.05表示差异显著。采用Illustrator CC 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 DMY对AF孢子和菌丝的MIC

如图1A所示，DMY对AF孢子萌发有显著抑制作用。其中，0、0.5 mg/mL时，因DMY质量浓度过低，暂无抑制作用；当DMY为1 mg/mL时，24 h和48 h时抑制率分别为24.41%和9.05%；2 mg/mL的DMY处理48 h后80.45%的孢子未萌发；当DMY质量浓度不低于4 mg/mL时，孢子萌发抑制率达到100%，即DMY对AF孢子萌发的MIC为4 mg/mL。如图1B所示，DMY对AF菌丝生长同样有显著抑制作用。当DMY质量浓度为2 mg/mL时，24、48、72 h时菌丝生长抑制率分别为95.00%、29.88%和16.98%；当DMY质量浓度不低于4 mg/mL时，抑制率达到100%，即DMY对AF菌丝生长的MIC为4 mg/mL，高于香芹酮（MIC＝1.5 mg/mL）、槲皮素（MIC＝1.0 mg/mL）等，但低于罗勒烯（MIC＝8.0 mg/mL），这种差异可能与AF孢子及不同菌株浓度有关。相同菌株接种浓度相同时，邻香兰素、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛（2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde，HMB）、丹皮酚、辛醛、壬醛、癸醛抑制AF菌丝生长的MIC分别为0.1、0.07、0.625、1.65、1.65、4.15 mg/mL。虽然DMY的MIC接近或高于上述天然化合物，但其作为抑菌剂仍然潜力巨大，这是由于：1）醛类化合物易挥发，在实际使用过程中不可避免存在损失，而DMY稳定性较高；2）DMY在37.5 mg/mL和0.01 mg/mL质量浓度下能够分别发挥保护肝脏和抗肿瘤活性，说明DMY还具有多重功效。这些结果为后续抑菌机理的探究奠定了良好的基础。

图1 DMY对AF孢子萌发（A）和菌丝生长（B）抑制率Fig. 1 Inhibition rate of DMY on spore germination (A) and mycelial growth (B) of A. flavus

2.2 DMY处理后AF孢子存活率和菌丝生物量

为了检测DMY在MIC质量浓度及以上处理后的孢子活力，本研究测定了孢子存活率和菌丝生物量。如图2A所示，对照组孢子存活率接近100%，而4、8、16 mg/mL的DMY处理组中孢子活力下降，孢子存活率分别为80%、65%和65%，表明DMY处理从一定程度上削弱了孢子的活力，且呈现剂量依赖关系。此外，进一步对菌丝的生物量进行量化分析，如图2B所示，对照组振荡培养24 h的菌丝生物量为4.95 mg，对照组振荡培养48 h菌丝生物量达57.65 mg。与对照组振荡培养48 h相比，经2 mg/mL的DMY处理后，菌丝生物量显著下降，下降比例为55.51%，4 mg/mL的DMY对菌丝生物量的降低效果最为显著，下降比例为88.93%。同时，0-24组和4-48组的菌丝生物量无显著差异（＞0.05），由此可知，4 mg/mL的DMY几乎能够完全抑制菌丝的生长。

图2 DMY处理后AF孢子存活率（A）和菌丝生物量（B）Fig. 2 Spore survival rate (A) and mycelial biomass (B) of A. flavus treated with DMY

2.3 细胞壁完整性观察结果

多糖是真菌细胞壁的主要成分，为细胞壁提供强度和硬度，如几丁质和-1,3-葡聚糖。细胞壁在向心力作用下向菌丝中心局部延伸形成隔膜，把菌丝内部分隔为不同的小室，且相邻的小室之间有细胞质的互通。已知荧光白染料可与几丁质特异性结合，而几丁质是细胞壁（隔膜）的主要成分，因此，荧光强度与细胞壁完整性有关。由图3可知，对照组菌丝隔膜完整且清晰透亮，表明几丁质含量较高。与对照组相比，1/2 MIC和MIC组隔膜数量依次减少，荧光强度依次减弱，表明DMY处理后，AF菌丝中几丁质含量减少，即细胞壁完整性被破坏。相似地，植物源天然化合物中的邻香兰素、HMB、丹皮酚等均能不同程度的溶解隔膜，在具有相似隔膜的酸腐菌中也发现，肉桂醛能够溶解隔膜，植物精油如紫苏精油能够从基因水平调控葡聚糖合成酶、几丁质酶等的表达。以上研究表明，细胞壁可能是植物源天然化合物抑菌的一个靶标，然而，哪些天然化合物能够被成功开发为靶向抑菌剂仍有待进一步研究。

图3 DMY处理后AF菌丝CW荧光染色图Fig. 3 CW fluorescence staining images of A. flavus treated with DMY

2.4 细胞膜完整性与细胞内容物释放量变化

对PI染色后的菌丝荧光强度进行量化，结果如图4A所示。随着DMY质量浓度的增加，相对荧光强度显著增加，1/2 MIC和MIC组分别是对照组的36.49 倍和257.69 倍。结果表明，DMY破坏了AF真菌细胞膜完整性，且这种破坏作用与DMY质量浓度成正比关系。已有许多研究报道醛类化合物具有疏水性，能够破坏细胞膜，导致细胞膜的通透性升高、完整性破坏。一些黄酮类化合物对真菌细胞膜的破坏作用与之相似，如乔松素和白杨素对意大利青霉以及黄芩素对烟曲霉的破坏作用。

细胞膜完整性的破坏可直接导致细胞内容物的渗出，因此，通过测定260 nm波长处的光密度值（OD）分析细胞内容物的释放情况，结果如图4B所示。当DMY质量浓度分别为0、1/2 MIC、MIC时，OD依次增加（分别为0.14、0.58和0.97）。与对照组相比，1/2 MIC组和MIC组光密度值分别增加了3.14 倍和5.93 倍。细胞内容物释放量的显著增加再次印证了细胞膜通透性的提高。

图4 DMY对AF细胞膜完整性（A）和细胞内容物释放量（B）的影响Fig. 4 Effects of DMY on the integrity of cell membrane (A) and the release of cell contents (B) of A. flavus

2.5 AF的相对电导率和pH值改变情况

由于渗出的细胞内容物具有导电性，因此，进一步通过细胞外相对电导率的变化趋势研究DMY对细胞膜破坏的程度。如图5A所示，对照组和DMY处理组均呈现了相对电导率升高的趋势。对照组的升高可能是细胞内外的渗透压导致的，1/2 MIC组的升高趋势和对照组接近，在180 min时约为43%，MIC组的升高最为显著，180 min时约为69.63%。这些结果表明细胞内的导电物质穿过完整性遭到破坏的细胞膜，且随着时间的延长，渗出的电解质逐渐增多。上述PI染色、OD及相对电导率的检测结果均间接表明了DMY处理后细胞膜受到了损伤，且该损伤呈现剂量依赖关系。

为了研究这些电解质的酸碱度，测定了不同质量浓度DMY处理后AF细胞外的pH值。如图5B所示，与对照组相比，DMY处理组细胞外pH值均升高，但随着时间变化，各组pH值均呈现略微下降的趋势，这可能与酸性物质的渗出有关。在180 min检测时间内，DMY处理组的pH值均明显高于对照组，推测处理组中有更多碱性物质渗出。pH值的变化趋势在不同天然产物处理的不同菌株中表现不同，如柠檬醛、辛醛和-松油醇3种挥发性化合物降低了柑桔地霉的pH值，HMB和丹皮酚均提高了AF菌丝胞外pH值。因此，pH值的变化趋势可能更多地与菌株类型有关。细胞膜位于真菌细胞壁和细胞质的中间，不仅是细胞的一层屏障，更能够参与调控、介导多种细胞功能，因此，细胞膜何种组分（脂质、蛋白等）、何种结构受到DMY的破坏仍有待深入研究。

图5 DMY处理下AF细胞外相对电导率和pH值的变化Fig. 5 Changes in extracellular relative conductivity and pH of A. flavus treated with DMY

2.6 DMY对AF呼吸代谢的影响

通过检测细胞外溶液中的溶解氧，能够了解AF消耗氧气的情况，进而通过计算呼吸抑制率分析DMY对AF呼吸的抑制作用。如图6所示，与对照组相比，DMY对AF的呼吸抑制率呈现剂量依赖关系，1/2 MIC和MIC组的呼吸抑制率分别为16.99%和25.82%。已有研究报道部分植物源天然化合物对真菌的呼吸代谢有抑制作用，如柠檬醛在MIC时抑制率达到21.20%，HMB在MIC时的抑制率达到33.33%，癸醛在MIC时抑制率达到58.94%。根据本实验结果虽尚无法全面揭示呼吸抑制原理，但由先前研究推测，该抑制作用可能与三羧酸循环途径或线粒体功能的破坏有关。

图6 DMY对AF的呼吸抑制率Fig. 6 Inhibition rate of DMY on A. flavus respiration

2.7 DMY对花生和玉米籽粒体外抑菌作用

花生和玉米易受AF侵染，因此，在上述人工培养液抑菌实验的基础上，本研究进一步评估了DMY对于防控AF污染的效果。AF的生长情况如图7所示，培养24 h时，除了两个MIC组，剩余花生和玉米籽粒上均观察到孢子的萌发。培养48 h时，对照组花生和玉米籽粒上均可观察到AF菌丝。培养72 h时，即便花生和玉米籽粒表面涂布有1/2 MIC的DMY，AF的生长情况也和48 h的对照组相似，而涂布MIC的DMY后花生和玉米籽粒表面则均无孢子萌发。对图7污染情况的量化结果如图8所示，培养72 h时，花生和玉米籽粒AF抑制率达到100%的均为DMY的MIC处理组。与培养液抑菌结果相同，4 mg/mL的DMY能够完全抑制AF侵染花生和玉米籽粒，因此，DMY具有开发为新型抑菌剂的潜力。

图7 DMY对花生（A）和玉米（B）籽粒的体外抑菌作用Fig. 7 In vitro antifungal effect of DMY on peanut (A) and corn (B) kernels

图8 DMY处理下花生（A）和玉米（B）籽粒的污染率Fig. 8 Contamination rates of peanut (A) and corn (B) kernels treated with DMY

3 结 论

本实验旨在研究DMY对AF的抗真菌效果及其作用机理，首先进行AF孢子萌发和菌丝生长的最小抑菌实验，然后通过CW和PI染色、细胞内容物释放以及细胞外pH值和相对电导率变化检测细胞壁和细胞膜完整性，并进行呼吸速率检测及花生和玉米籽粒体外抑菌实验。研究获得的初步结论如下：DMY对AF孢子萌发和菌丝生长的MIC均为4 mg/mL，其通过破坏细胞壁和细胞膜的完整性发挥抑菌作用。DMY处理后线粒体是否遭到破坏仍需进一步的实验证明。此外，DMY能够有效抑制AF侵染花生和玉米籽粒，未来有望将其开发为新型抑菌剂应用于粮食及农产品的储藏。