红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的抗炎活性

张馨方，杨亚兰，张 慧，罗非君，任佳丽

（中南林业科技大学食品科学与工程学院，林产可食资源安全与加工利用湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004）

萜类化合物是分子式为异戊二烯单位倍数的烃类及其衍生物，广泛分布在植物、动物和大型真菌中，结构多样。目前已报道的萜类化合物的结构大约有50 000种，其中绝大多数萜类物质具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、抗人类免疫缺陷-1病毒、降血糖、降血脂等活性。食用菌中的萜类多为倍半萜、二萜和三萜。红汁乳菇（）是一种美味的食药用真菌，具有独特的风味和丰富的营养物质，广泛分布在我国的湖南、安徽、福建、四川、湖北和广西等地。目前对红汁乳菇中萜类物质的研究仅停留在初步的分离纯化及结构解析上，对其生物活性尤其是抗炎活性的研究较少。因此，红汁乳菇中的萜类化合物具有巨大的研究价值和开发潜力。

炎症是机体的自我防御反应，主要的表现有局部红肿、发热、疼痛和功能性障碍，伴随着白细胞数量增多和单核巨噬细胞增生等全身反应，长时间的炎症会使机体产生一系列的异常应激反应，对机体自身造成不同程度的伤害，如引起动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、糖尿病等多种疾病，严重时甚至会导致癌症。大量研究表明多种食用菌具有抗炎的作用，主要是通过减少炎症介质的产生来达到抗炎的效果。

巨噬细胞在免疫系统中起到关键作用，致炎因子会诱导巨噬细胞分泌大量的炎症因子，从而诱导炎症反应发生。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导巨噬细胞模型常用于体外炎症反应模拟，主要是通过检测炎症因子基因和蛋白相对表达水平的变化来评价活性物质的抗炎效果。当LPS作用巨噬细胞后，炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin，IL）-1β、IL-6等表达量会显著增加，并进一步促进其他炎症介质的产生，从而引发炎症。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是介导细胞反应的一种重要激酶，其信号传导主要是三级激酶的传递模式，通过细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK（以下简称p38蛋白）等蛋白质的磷酸化来调节多种细胞生理过程。因此，本研究以LPS诱导RAW264.7巨噬细胞为炎症模型来评估红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，并初步探究红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物对MAPK通路的影响，旨在为红汁乳菇的精深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜红汁乳菇 长沙市马王堆市场；甲醇（分析纯）、氯仿（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、丙酮（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；石油醚天津恒兴化学品有限公司；柱色谱硅胶200～300 目青岛海洋化工有限公司；1640培养基、胎牛血清、双抗（青霉素、链霉素）、0.25%胰蛋白酶 美国Gibco公司；细胞增殖检测（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2-tetrazolium，MTS）试剂盒、反转录试剂盒 美国Promega公司；TransZol、Green qPCR SuperMix UDG试剂盒 北京全式金生物技术有限公司；RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 北京索莱宝科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；-actin抗体、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、IL-6、TNF-α、IL-1β一抗、磷酸化-MAPK（phospho-MAPK，P-MAPK）/MAPK抗体试剂盒、二抗抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G-辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、抗小鼠IgG1-辣根过氧化物酶显色液试剂盒 美国CST公司。

1.2 仪器与设备

LABORATA 4001旋转蒸发仪 德国海道尔夫集团；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；Bruker-100核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 德国布鲁克公司；DNM-9602酶标仪 北京普朗新技术有限公司；XDS-10倒置生物显微镜 上海团结仪器制造有限公司；JY-SPCT水平电泳槽、JY300C电泳仪 北京君意东方电泳设备仪器公司；721-BR10883凝胶成像仪、CFX96 Touch实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的提取与结构分析

愈创木烷型倍半萜化合物的提取：将新鲜的红汁乳菇子实体用组织破碎机搅碎，室温下静置3 h后按照料液比1∶3（/）加入丙酮，室温下静置24 h进行浸提，过滤收集滤液，按照此操作浸提3 次，合并3 次的提取液。然后按照料液比1∶3（/）在滤渣中加入甲醇-氯仿混合溶液（体积比1∶1），室温静置浸提24 h，过滤收集滤液，按照此操作浸提2 次。合并收集的滤液，35 ℃旋转蒸发除去溶剂，得到黑色浸膏。将上述全部黑色浸膏溶于150 mL乙酸乙酯，然后加入等体积水，收集乙酸乙酯相（上层）后于35 ℃真空蒸发除去溶剂，得到浸膏。柱层析：称取一定质量（约为样品质量30～70 倍）的200～300 目硅胶，将浸膏用纯石油醚进行洗脱，收集蓝色组分，35 ℃旋转蒸发除去溶剂后将样品冻干，得到愈创木烷型倍半萜化合物备用。

紫外-可见波段图谱扫描：将0.1 mg愈创木烷型倍半萜化合物样品溶于10 mL无水乙醇中，以无水乙醇为参比溶液进行全波长（200～800 nm）扫描，确定红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物的最大吸收波长。

高效液相色谱分析：称取0.1 mg愈创木烷型倍半萜化合物，加入10 mL无水甲醇（色谱级）溶解，然后用无水甲醇稀释10 倍，经0.22 μm滤膜过滤后备用。LC-20A高效液相色谱仪配备ODS C色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相纯甲醇（色谱级），流速1 mL/min，检测波长289 nm。

质谱条件：取液相色谱分析中制备的样品进行质谱分析，质谱离子源为正离子ESI扫描，电离电压3.5 kV，分辨率70 000，质量范围100～1 500/。

NMR分析：称取愈创木烷型倍半萜化合物10 mg，溶于0.5 mL氘代二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），进行氢谱、碳谱检测，共振频率400 MHz。

1.3.2 巨噬细胞RAW264.7细胞培养与细胞活性的测定

将RAW264.7细胞在含10%（体积分数）胎牛血清和1%（体积分数）双抗（青霉素和链霉素）的1640细胞培养基（即完全培养基）中培养，并置于37 ℃、5% CO培养箱中，每2 d进行换液、传代。取对数生长期的RAW246.7细胞，经0.25%（质量分数）胰蛋白酶消化后吹打均匀，用1640培养基稀释至细胞密度为6×10个/mL，以每孔100 μL接种于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO培养箱中培养。待细胞贴壁后吸弃培养基，每孔加入含红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物（终质量浓度为0、25、50、100 μg/mL）的1640培养基，每组设置5个平行，重复3 次，轻轻振荡，放入培养箱培养20 h后，每孔加入20 μL MTS溶液（5 mg/mL）。再次培养4 h后，采用酶标仪测定每个孔490 nm波长处的吸光度，以表征细胞活性；同时采用显微镜观察细胞形态变化和生长情况（放大倍数为400×）。

1.3.3 LPS诱导巨噬细胞RAW264.7炎症模型实验分组

实验分为5 组：空白对照组、LPS模型组、不同质量浓度（25、50、100 μg/mL）红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物组。参照1.3.2节方法将处于对数生长期的RAW246.7细胞经胰蛋白酶消化后，以10个/mL接种于6 孔板中，每孔1 mL，待细胞贴壁完全后吸弃培养液，然后按照分组加入不同培养基。红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物组：分别加入1 mL含不同质量浓度（25、50、100 μg/mL）红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物的完全培养基后在培养箱中孵育3 h，加入LPS使其终质量浓度为1 µg/mL；LPS模型组：加入1 mL含LPS（终质量浓度为1 µg/mL）的完全培养基；空白对照组：加入1 mL完全培养基。细胞培养24 h后，收集细胞做进一步分析。

1.3.4 荧光定量PCR检测相关炎症因子的mRNA相对表达水平

取1.3.3节收集的细胞，用磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.2～7.4，下同）清洗2 次，用1 mL TransZol提取细胞总RNA，0.8%（质量分数）琼脂糖胶电泳分析RNA的完整性和浓度，用反转录试剂盒合成cDNA后进行PCR。引物序列如表1所示，PCR反应条件：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s，60 ℃，40 s，72℃，1 min，40个循环。采用2法计算相关炎症因子的mRNA相对表达水平。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.3.5 Western blot法检测蛋白相对表达水平

取1.3.3节各组的细胞，用磷酸缓冲液清洗2 次，加入0.3 mL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液裂解细胞，然后4 ℃、13 000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测蛋白浓度，取20 μg的蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，再将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用5%牛血清白蛋白封闭液在室温下封闭 1 h，然后与一抗在4 ℃下孵育12 h，TBST清洗3 次，膜与二抗在室温下孵育 1 h 后，再用TBST清洗3 次，最后用曝光仪曝光拍照，并采用Image J软件进行定量分析。

1.4 数据统计与分析

所有实验均重复3 次，结果用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，采用检验进行显著性分析，＜0.05为差异显著，＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的结构解析

对分离纯化所得的化合物进行结构分析，图1为紫外-可见波段扫描图谱，在244、289、376 nm有3个吸收峰，最大吸收波长在289 nm处，根据Woodward-Fieser经验规则，推测所得的化合物可能存在4个共轭双键。由图2可知，在6.5 min处有一高强度峰，根据面积归一法初步推导其纯度为96.7%。由图3可知，在正离子模式下，所得的化合物的分子离子峰为/197.172 8。H NMR（图4）和C NMR（图5）的解析结果为，H NMR（DMSO-d6，400 MHz）：8.36（1H，d，＝2.0 Hz，H-8），7.69（1H，dd，＝10.9 Hz，2.0 Hz，H-6），7.64（1H，d，＝3.8 Hz，H-2），7.30（1H，d，＝3.8 Hz，H-3），7.07（1H，d，＝10.9 Hz，H-5），5.37（1H，brs，H-13a），5.20（1H，brs，H-13b），2.79（3H，s，H-14），2.62（3H，s，H-15），2.26（3H，brs，H-12）；C NMR（DMSO-d6，100 MHz）：146.4（s，C-4），145.1（s，C-11），136.9（s，C-7），136.5（d，C-8），135.0（s，C-10），134.0（d，C-6），132.8（s，C-9），131.7（d，C-5），127.1（s，C-1），124.5（d，C-2），114.4（t，C-13），113.8（d，C-3），23.5（q，C-14），22.9（q，C-12），12.8（q，C-15）。图4和图5结果与文献[30]报道基本一致，故可以得出该化合物分子式为CH，结构式如图6所示，为愈创木烷型倍半萜化合物。

图1 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的紫外-可见波段扫描图谱Fig. 1 UV-Vis spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

图2 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的高效液相色谱图Fig. 2 High performance liquid chromatogram of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

图3 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的质谱图Fig. 3 Mass spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

图4 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的1H NMR图Fig. 4 1H NMR spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

图5 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的13C NMR图Fig. 5 13C NMR spectrum of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

图6 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的结构式Fig. 6 Structural formula of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake

2.2 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对巨噬细胞形态和活性的影响

分别利用完全培养基（空白对照组）和含红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物（25、50、100 μg/mL愈创木烷型倍半萜化合物）的完全培养基培养巨噬细胞24 h后，观察细胞形态变化和生长情况，如图7所示，空白对照组和实验组的巨噬细胞形态均完整无缺。MTS法检测愈创木烷型倍半萜化合物对巨噬细胞活性的影响，如图8所示，空白对照组和实验组（25、50、100 μg/mL愈创木烷型倍半萜化合物）的吸光度分别为0.861±0.03、0.849±0.034、0.845±0.028、0.844±0.029，实验结果表明，空白对照组和实验组的吸光度没有显著差异（＞0.05），说明质量浓度为25、50、100 μg/mL的红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物不会影响巨噬细胞的活性，因此选择这3个质量浓度进行后续实验。

图7 显微镜观察红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对巨噬细胞形态的影响（400×）Fig. 7 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on morphology of macrophage RAW264.7 cells (400 ×)

图8 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对巨噬细胞活性的影响Fig. 8 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the viability of RAW264.7 cells

2.3 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞炎症因子mRNA相对表达水平的影响

为了在基因水平上确定红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，采用PCR测定各组细胞中、、和mRNA的相对表达水平，结果如图9所示。通过对比空白对照组、LPS模型组和实验组（25、50、100 μg/mL愈创木烷型倍半萜化合物）细胞炎症因子mRNA的相对表达水平可知：和空白对照相比，LPS模型组的、、和mRNA相对表达水平明显升高，说明LPS成功诱导巨噬细胞产生炎症反应，且这些细胞因子与LPS诱导的炎症反应密切相关；和LPS模型组相比，实验组中、、、mRNA表达水平均极显著下降（＜0.01），且随着愈创木烷型倍半萜化合物质量浓度不断升高，表达量均不断降低，呈现较好的浓度依赖性，说明该愈创木烷型倍半萜化合物能极显著降低由LPS诱导的RAW264.7细胞中、、、mRNA相对表达水平（＜0.01）。

图9 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞炎症因子mRNA相对表达水平的影响Fig. 9 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the relative mRNA expression level of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells

2.4 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞炎症因子蛋白相对表达水平影响

为了在蛋白质水平上确定红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物的抗炎活性，采用Western blot法检测相应炎症因子蛋白质的表达，结果如图10所示。和空白对照组相比，模型组的COX-2、IL-1β、iNOS、TNF-α、IL-6的相对表达水平均明显升高，说明LPS成功诱导巨噬细胞产生炎症反应。与已经诱导产生炎症反应的模型组细胞相比，实验组的COX-2、TNF-α、iNOS的蛋白相对表达水平均随着该愈创木烷型倍半萜化合物质量浓度的升高而递减，对于IL-1β和IL-6，仅有高质量浓度的愈创木烷型倍半萜化合物（100 μg/mL）能够使其相对表达水平极显著降低（＜0.01）。实验结果说明一定质量浓度的红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物能降低LPS刺激的巨噬细胞中炎症因子COX-2、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α的表达。

图10 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞炎症因子蛋白相对表达水平的影响Fig. 10 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the relative protein expression levels of inflammatory factors in LPS-induced RAW264.7 cells

2.5 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞中通路MAPK磷酸化的影响

为进一步研究红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物抵抗炎症发生的机制，研究了其对MAPK信号通路变化的影响，结果如图11所示。与空白对照组相比，LPS可以刺激巨噬细胞中磷酸化-JNK（phospho-JNK，p-JNK）、磷酸化-p38（phospho-p38，p-p38）、磷酸化-p44/42（phospho-p44/42，p-p44/42）蛋白相对表达水平明显升高；与LPS模型组相比，不同质量浓度的红汁乳菇愈创木烷型倍半萜化合物对p-p38蛋白表达的抑制效果较小且较为相近，当质量浓度达到100 μg/mL时，样品会使p-JNK蛋白的表达明显降低，而经梯度质量浓度的该愈创木烷型倍半萜化合物处理后，巨噬细胞中p-p44/42蛋白相对表达水平逐渐下降。结果表明一定剂量的红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物处理能极显著降低p44/42、p38和JNK 3种蛋白激酶的磷酸化水平（＜0.01），从而抑制MAPK炎症通路的活化。

图11 红汁乳菇中愈创木烷型倍半萜化合物对LPS诱导巨噬细胞MAPK通路中蛋白磷酸化水平的影响Fig. 11 Effect of guaiane sesquiterpenoids from Lactarius hatsudake on the phosphorylation of proteins involved in the MAPK signaling pathway in LPS-induced RAW264.7 cells

3 结 论

本研究从新鲜红汁乳菇子实体中提取愈创木烷型倍半萜化合物，发现该化合物在0～100 μg/mL不会影响巨噬细胞的活性，采用LPS诱导RAW.264.7巨噬细胞模型，发现该化合物可以抑制炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS的分泌与表达；同时，可以降低p44/42、p38和JNK 3种蛋白激酶的磷酸化水平，通过抑制MAPK通路的活性，下调炎症因子的表达，具有良好的抗炎活性。本研究对红汁乳菇精深加工产品的开发具有一定的指导意义。