葡萄柚嫁接愈合过程中砧穗生理物质特性及其与嫁接亲和性的关系

朱太富， 王 赟， 苏效兰， 李 欣， 王连春

(1.西南林业大学园林园艺学院，云南昆明 650224； 2.西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南昆明 650224)

葡萄柚(Macf.)属于芸香科柑橘属，果实像葡萄一样一簇一簇地垂挂，故称之为葡萄柚。葡萄柚的果实品质较好，一般用于鲜食，也可以制做果肉罐头和果汁。嫁接是葡萄柚苗木繁育的关键技术，接穗与砧木的亲和性和嫁接后的愈合情况对葡萄柚的生长、开花和结果等均有显著影响。周洲以红玉葡萄柚和马叙无核为接穗，嫁接于9种砧木上，研究发现不同嫁接组合的愈合情况、花期和果实产量出现显著差异。王伟军等研究表明，不同砧穗组合在结果早晚、树形矮化程度等方面均存在差异。严毅等认为，关键酶的含量对葡萄柚嫁接苗的愈合具有一定的影响。已有研究表明，可溶性蛋白和碳水化合物对于砧穗组合之间连接的早期生长阶段非常重要，嫁接后有大量的高尔基体出现在隔离层细胞中，增加的高尔基体会分泌蛋白质和碳水化合物在接穗和砧木间形成初始黏连。前人对葡萄柚的研究主要集中在葡萄柚果实营养和健康功效、嫁接生理酶活性、组织培养、遗传育种等方面，而对于葡萄柚嫁接愈合形成过程中接穗和砧木的代谢物质含量变化以及酶活性与嫁接亲和性的研究较少。因此，本研究以本地酸柚为砧木，火焰、哈路比、瑞路比和星路比为接穗，通过比较不同嫁接组合砧穗中的生理指标差异，以及分析砧穗中的生理指标与嫁接后的成活率所存在的关系，为研究葡萄柚嫁接亲和性的早期预测以及砧木与接穗组合的选择奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地及材料概括

试验地为西南林业大学格林温室旁的露天试验地(102°45′E，25°03′N)，年平均气温为15 ℃，年平均降水量约为1 000.5 mm，年日照时长为 2 327.5 h。以星路比(Star Ruby)、哈路比(Hudson Foster)、瑞路比(Ray Ruby)、火焰(Flame)4个葡萄柚品种母树树冠上部四周一年生健壮枝条作为接穗，以营养袋苗本地酸柚()为砧木，不同砧穗组合的情况及简写见表1。

表1 不同砧穗组合情况

1.2 试验方法

试验开展于2021年3月26日。选取健壮枝条，剪为3～4 cm长，每一段留1～2个饱满芽。砧木距离基质土壤表面6 cm处平减，采用劈接法，分别将4种接穗嫁接到砧木上。嫁接完成后，搭建高约1.5 m，50%的遮阳网进行遮阴处理。嫁接愈合前，每隔3 d浇1次水，愈合后每隔5 d浇1次水，浇水时避免水溅湿嫁接口。试验采用3次重复，随机区组设计，共4个砧穗组合，每30株作为一个小区，共5个小区，其中一个小区用于嫁接成活率的统计，另一个小区用于嫁接愈合情况的观察，其他3个小区用于采样，每个组合共嫁接150株。成活率=嫁接后40 d接穗芽萌动的株数/嫁接株数×100%。

1.3 样品采集及测定

为探究嫁接愈合过程中相关物质的变化，故在嫁接后0、2、4、6、14、22、30 d分别取1次样，其中 0 d 取样时，接穗为刚从母株上随机取下3 cm长度除去叶片的枝条，砧木取距离基质土壤表面3～6 cm 长度未经嫁接的砧木。取样时从每个小区中取2株嫁接苗，死亡萎蔫的不取样，用枝剪将距离嫁接口3 cm处的砧木和接穗剪下，刀片刮取砧木和接穗的韧皮部，分别剪碎后，用锡箔纸将剪碎的韧皮部分别包裹，将包裹好的韧皮部放入液氮中冷冻后储藏于超低温冰箱中。嫁接后40 d时统计成活状况，接穗芽萌动则表示嫁接成活。砧木和接穗中的可溶性糖与淀粉含量参照张志良等的蒽酮比色法测定，可溶性蛋白含量参照张志良等的考马斯亮蓝染料结合法测定，过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性参照李合生的方法测定。POD酶活单位U：在波长为470 nm下，1 min 1 g葡萄柚韧皮部组织在反应体系中吸光度变化1所需的酶量；PPO酶活单位U：在波长为 420 nm 下，1 min 1 g葡萄柚韧皮部组织在反应体系中吸光度变化0.01所需的酶量。

1.4 数据处理

数据统计使用Excel 2010软件进行，用Origin 2021进行作图，采用SPSS 26.0软件进行方差分析、多重比较和相关性分析(Duncan’s 新复极差法)。

2 结果与分析

2.1 不同嫁接组合愈合情况的观察

砧穗的亲缘关系越近，嫁接后愈合得越好，因此嫁接后的愈合情况可以作为判断亲和性高低的指标。本试验参照严毅等的方法，嫁接后观察不同嫁接组合砧穗的愈合情况。由表2可知，最先出现愈伤组织的组合为Z3S3和Z4S4，Z2S2、Z1S1组合的形成时间分别为7、8 d。在14 d 时，Z3S3组合的愈合情况最好，形成的愈伤组织植株数最多。

表2 不同嫁接组合的愈合情况观察

2.2 不同嫁接组合的成活率

嫁接植株的成活率反映了接穗和砧木之间的亲和性，两者之间存在正相关关系。嫁接后 40 d，对4个嫁接组合的成活率进行统计。由图1可知，Z3S3组合的嫁接成活率最高为73.33%，Z2S2组合的嫁接成活率最低为46.67%。从显著性分析可以得出，Z3S3组合的成活率显著高于其他的嫁接组合，Z2S2嫁接组合的成活率显著低于其他的嫁接组合，而Z1S1和Z4S4这2个嫁接组合之间的成活率不存在显著性差异。

2.3 不同嫁接组合的可溶性糖和淀粉含量

由表3可知，在嫁接愈合过程中，接穗中可溶性糖含量都呈降低—升高—降低的变化趋势，嫁接后前14 d接穗中可溶性糖含量整体逐渐降低，降低了4.83%～64.65%。与其他几个接穗相比较，S3的可溶性糖含量最先上升，且上升幅度最大。由表3可知，嫁接后不同嫁接组合砧木中可溶性糖的含量整体呈现升高—降低—升高的趋势。在嫁接后的前4 d，砧木中可溶性糖含量均呈上升趋势，Z3的可溶性糖含量上升了8.73%，上升幅度最大，可溶性糖含量上升最低的为Z4，上升了5.41%，可见嫁接初期，不同嫁接组合砧木的可溶性糖含量变化不大。4 d以后，不同嫁接组合的砧木中可溶性糖含量变化情况几乎一致。由显著性分析可知，不同的采样时间同一接穗的可溶性糖含量有部分存在显著差异，对应砧木的情况与接穗相同。同一采样时间内，同一个嫁接组合接穗和砧木之间的可溶性糖含量全部都存在极显著差异。

由表3可知，嫁接后接穗中的淀粉含量均呈现下降—上升的变化趋势。在所有接穗中，S3的淀粉含量下降幅度最大，下降53.90%。6 d后，Z2砧木的淀粉含量开始上升，其余砧木的淀粉含量在14 d后才开始上升。与其他砧木相比，Z3淀粉含量下降最多，下降46.32%。同一取样时间同一嫁接组合接穗和砧木的淀粉含量均存在极显著差异，但各嫁接组合的砧木，只有Z3在所有取样时间所测得淀粉含量存在显著差异。

表3 不同嫁接组合的可溶性糖和淀粉含量

2.4 不同嫁接组合的POD和PPO活性

由表4可知，随着嫁接口的愈合，不同嫁接组合中接穗的POD活性变化为升高-下降趋势，砧木的POD活性变化趋势与接穗相同。22 d时，Z3S3组合接穗和砧木的POD活性比Z1S1、Z2S2、Z4S4组合的高，Z3S3组合接穗和砧木中的POD活性分别是嫁接0 d的306.25%、286.45%。从总体来看，Z3S3组合POD活性在不同取样时间变化最明显，Z1S1和Z4S4组合次之，Z2S2组合POD活性变化幅度最小。14 d时，用接穗的POD活性剪去砧木的POD活性，所得的差值取绝对值，Z1S1、Z2S2、Z3S3、Z4S4组合的差值分别为0.99、5.64、9.54、8.43 U/g，接穗与砧木间的POD活性存在极显著差异的嫁接组合为Z2S2、Z4S4。

由表4可知，随着嫁接口的愈合，4个组合接穗的PPO活性表现为升高-降低的趋势，砧木的PPO活性表现为降低-升高的趋势，砧穗的PPO活性变化趋势不一致。4个组合中，与0 d相比，Z2S2组合接穗的PPO活性升高了41.17 U/g，Z3S3组合接穗的PPO活性仅升高3.74 U/g。整个嫁接愈合过程中，Z3S3组合砧木的PPO活性变化幅度最大，而该组合接穗的变化幅度最小。14 d时，用接穗的PPO活性减去砧木的PPO活性，所得的差值取绝对值，Z1S1、Z2S2、Z3S3、Z4S4组合的差值分别为8.93、16.67、13.7、7.11 U/g，各组合接穗和砧木之间的PPO活性均存在极显著差异。

表4 不同嫁接组合的POD和PPO活性

2.5 不同嫁接组合的可溶性蛋白含量

由表5可知，0～14 d接穗中可溶性蛋白含量下降10.57%～30.60%，4个组合中，Z3S3组合接穗的可溶性蛋白含量下降最少。14 d时与其他接穗相比，S3的可溶性蛋白含量最先开始出现上升，且可溶性蛋白含量最高。从表5中数据可以看出，4个组合所对应砧木的可溶性蛋白含量均整体表现为降低—升高的变化趋势。此外，同一采样时间同一组合的接穗和砧木之间可溶性蛋白含量部分存在极显著差异，Z3S3组合中除2 d外均存在极显著差异。

表5 不同嫁接组合的可溶性蛋白质量分数

2.6 不同嫁接组合成活率与其砧穗生理指标的关系

由表6可知，在嫁接愈合过程中，嫁接成活率与砧穗中的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量以及POD和PPO活性存在一定的相关性。嫁接后2 d，嫁接成活率与接穗和砧木可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量等指标的相关性不显著，嫁接后4、22、30 d砧穗的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量均与嫁接成活率无显著相关性，嫁接后6 d，各组合接穗中的生理指标与嫁接成活率均存在显著正相关的为可溶性糖和可溶性蛋白含量，与嫁接成活率存在显著负相关的为淀粉含量。嫁接后6、22、30 d，嫁接成活率与砧穗的POD活性均存在极显著正相关关系；嫁接后4、6、14、22、30 d，嫁接成活率与砧穗的PPO活性均存在极显著负相关。

表6 嫁接成活率与砧穗生理指标的相关性分析

3 讨论

3.1 嫁接成活率

嫁接作为植物常见的无性繁殖方法之一，被广泛应用于增强植物抗逆性、良种选育、改善作物农艺性状等方面的研究。接穗与砧木在分类学上关系越近，嫁接后愈合得越好，成活率越高，杨邵等在研究油茶不同芽苗砧嫁接组合的亲和性生理中，也将嫁接成活率和愈伤组织的出现时间作为判断嫁接亲和性的依据。本研究中，嫁接40 d时Z3S3组合的嫁接成活率为73.33%，显著高于其他组合，同时，该嫁接组合的愈伤组织最先形成，这些表明Z3S3组合的亲和性更高。

3.2 代谢物质

在植物嫁接愈合部位会发生许多代谢物质含量和酶活性的变化。营养物质是细胞分裂与分化的重要物质基础和能量来源。本试验结果表明，嫁接后0～14 d，不同砧穗中的可溶性糖含量整体均呈现降低的变化趋势，出现这种情况的原因可能是因为嫁接初期，砧穗需要消耗大量的糖维持正常的生理活动，故可溶性糖的含量降低。而14 d以后，嫁接口逐渐愈合完全，砧穗间的物质交换和流通逐步恢复正常，接穗中的可溶性糖含量开始上升，但低于嫁接0 d的含量，而砧木中的可溶性糖含量几乎维持不变，这与在王瑞等的研究中，可溶性糖的含量变化趋势相同，也与龚艳箐等对蜜柚嫁接后可溶性糖含量的变化研究结果一致。

淀粉是一种高分子碳水化合物，可在植物中储存能量，在裂解酶和水解酶作用下淀粉分解为寡糖，为细胞提供能量。本研究发现，嫁接初期接穗刚脱离母体，需要消耗自身淀粉来维持代谢，这使得接穗中淀粉含量整体呈现下降趋势。14～22 d，淀粉含量持续降低，分解补充可溶性糖含量，可溶性糖含量在此阶段有所升高，为嫁接口的愈合提供足够营养。14 d后嫁接口逐渐愈合完全，可溶性糖转化为淀粉储存，淀粉含量略微升高。

作为植物组织中的功能性蛋白，可溶性蛋白含量越高，植物体的代谢活动越强。本研究S3中可溶性蛋白含量在6 d后开始升高，而其余接穗中可溶性蛋白含量在14或22 d后才开始上升，可见S3的代谢活动强于其余接穗。接穗中可溶性蛋白含量高，代谢也就越旺盛，营养物质含量也就越高，嫁接口的薄壁细胞分裂迅速，嫁接口愈合得更快。Z3中可溶性蛋白的含量大于其他砧木，可见Z3的生命活动更旺盛，更有利于嫁接成活，曲云峰在大扁杏嫁接研究中也认为可溶性蛋白含量越高，嫁接体愈合越快。

3.3 氧化酶活性

植物抗氧化防御系统中的POD，在砧穗愈合过程中不仅可以清除自由基并抑制膜脂过氧化，同时维管组织的木质化也进一步提高。因此，为了抵御嫁接口产生的过氧化氢等有害物质，在嫁接后的一段时间内，POD活性会增加，后期随着嫁接口愈合，其活性会逐渐降低。本研究中各嫁接组合接穗和砧木的POD活性均表现为先升高后降低的趋势，这与李娜等的研究结果一致。14 d时，Z3S3组合砧穗的POD活性差异较小。POD活性与嫁接成活率的相关性分析表明，砧穗POD活性越高，嫁接成活率也越高，两者之间存在正相关关系。在嫁接愈合的初期，PPO主要作用于接穗与砧木间木质素的合成。同时，在嫁接亲和性较低的组合中，因PPO将多酚氧化为醌类物质而在嫁接口聚集形成一层膜，从而导致砧穗愈合情况较差。此外，嫁接后PPO过高可引起愈伤组织褐化不利于嫁接成活，通常PPO活性越高的嫁接组合，接穗和砧木亲缘关系越远。本研究表明，嫁接初期各组合接穗的PPO活性变化趋势相同，砧木的PPO活性变化趋势也相同，Z3S3组合接穗和砧木的PPO活性比其他组合较低，说明PPO活性越低越有利于嫁接成活，砧穗的PPO活性均与嫁接成活率呈负相关关系。

4 结论

对各嫁接组合嫁接后愈合情况的观察、愈伤组织出现的时间以及砧穗中内含物质的分析比较可以得出，以本地酸柚为砧木嫁接瑞路比葡萄柚的亲和性较高，表现为成活率较高，砧穗中可溶性糖和淀粉含量变化明显，POD活性较高和PPO活性较低等特点，通过嫁接愈合情况观察也发现，以本地酸柚为砧木与瑞路比嫁接后，愈伤组织出现时间较早愈合情况较好。总之，本地酸柚与瑞路比葡萄柚的嫁接亲和性显著高于其他嫁接组合，根据不同采样时期接穗和砧木中生理指标含量的相关性分析可以得出，葡萄柚嫁接愈合过程中砧穗的营养物质含量变化及POD和PPO活性的高低可以在一定程度上反映出嫁接组合亲和性的高低。