黏虫HSC70互作蛋白基因HIP的分子特征与时空表达分析

李鸿波， 符俊洪， 冯 磊

(1.贵州省农业科学院植物保护研究所，贵州贵阳 550006； 2.贵州大学昆虫研究所，贵州贵阳 550025)

黏虫别称行军虫，属鳞翅目夜蛾科，是我国和其他亚洲国家及澳洲的重大迁飞性害虫。该虫的寄主十分广泛，可危害玉米、水稻、小麦等100多种作物，主要通过幼虫取食寄主植物的叶片，影响作物的光合作用，从而造成农作物减产。上世纪50—80年代期间，黏虫多次在全国范围内暴发成灾，造成严重的经济损失。90年代后，随着全国小麦种植面积锐减，加之测报与防治技术的完善，黏虫得到有效控制。近年来，受耕作制度和全球气候变化等因素的影响，黏虫在我国局部地区暴发，其暴发频率、危害程度及危害面积为近20年之最，对我国的粮食安全生产已构成严重威胁。黏虫的暴发与其迁飞为害和暴食能力相关，其强大的生殖能力也是其暴发的重要原因。黏虫无滞育特性，在适宜条件下1年可以繁殖数代，雌成虫可多次交配，单雌产卵量达500～1 000粒。昆虫的产卵主要受生殖相关基因的调控，因此开展黏虫生殖相关基因的研究可望为该害虫的防治提供新途径。

卵黄发生是昆虫生殖调控的关键，与昆虫种群数量的消长密切相关。目前，关于黏虫生殖的研究主要集中在卵黄原蛋白及其受体方面。例如，在黏虫中已经报道了2个卵黄原蛋白(vitellogenin，简称Vg)及其受体(vitellogenin receptor，简称VgR)基因，发现这2个基因主要在黏虫雌成虫脂肪体和卵巢高表达；进一步研究发现，沉默相关基因后黏虫卵的形态畸形，产卵量明显下降，从而验证了这2个基因在黏虫生殖中的功能。昆虫的生殖是一个复杂的过程，受多个基因的调控。热激蛋白(HSPs)作为一种分子伴侣在昆虫抵御环境胁迫中发挥重要作用，然而近年来的研究发现HSPs参与多种昆虫的生殖。以飞蝗为例，研究发现和在飞蝗的脂肪体中高表达；沉默这2个基因后导致飞蝗卵黄蛋白表达水平显著降低，同时卵母细胞发育迟缓；敲除和后飞蝗Vg的合成和卵母细胞的成熟严重受阻。这些结果表明，HSPs通过调控昆虫Vg的合成而控制昆虫的生殖。然而，HSPs是否参与黏虫的生殖还未见报道。

HSC70互作蛋白(HSC70 interacting protein，简称HIP)是一种高度保守的协同分子伴侣。该蛋白主要通过由34个氨基酸组成的保守结构域TPR(tetratricopeptide repeats)与HSC70 C-端的EEVD结合，从而调控HSC70的功能。目前，HIP已在人类、拟南芥、果蝇、番茄等生物中被相继报道，并已证实其在生物抵御各种生物胁迫中发挥重要作用。然而，HIP在参与动植物生殖的研究还未见报道。最近，笔者所在课题组在分析黏虫4日龄雌虫卵巢转录组数据时发现，在卵巢中高表达，暗示其可能在黏虫的生殖中具有重要作用。为此，本研究采用RT-PCR从黏虫克隆了的基因，并采用实时荧光定量PCR分析了其在黏虫不同发育时期，4日龄雌成虫不同组织中的表达模式，以期为进一步研究在黏虫生殖中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验时间

试验于2021年1—3月在贵州省植物保护研究所完成。

1.2 供试虫源及试剂

供试虫源：本试验所用黏虫为长期饲养在贵州省植物保护研究所的室内种群，至今饲养30代以上，期间未接触任何杀虫剂。饲养条件为光—暗周期 14 h—10 h、温度为24～25 ℃、湿度为70%～80%，具体饲养过程参照李鸿波等的方法进行。

供试试剂：EastepR Super Total RNA isolation Kit购自Promega公司；cDNA第1链反转录试剂盒购自Thermo 公司；iScriptcDNA Synthesis Kit和SsoAdvancedUniversal SYBR Green Supermix购自Bio-RAD公司；LA酶、DL2000 marker等购自TaKaRa公司；其他试剂为国产分析纯。

1.3 总RNA提取，cDNA第1链合成和RT-PCR

按照Eastep® Super Total RNA isolation Kit提供的方法提取样品总RNA，利用DNAaseI 去除基因组DNA，并采用oligo(dT)引物(Thermo Scientific，USA) 合成 cDNA第1链，存于-20 ℃下备用。基于笔者所在实验室前期的转录组数据分析，鉴定得到1个长1 218 bp的基因序列，初步分析发现该基因具有完整的开放阅读框。据此序列设计1对特异性引物，以4日龄雌成虫卵巢反转录而来的cDNA为模板，采用RT-PCR进行扩增(表1)，扩增参数为：94 ℃ 预变性3 min；94 ℃ 变性30 s，54 ℃ 退火 1 min，72延伸30 s，共30个循环；最后在72 ℃下再延伸10 min。 反应结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将符合目标条带大小的PCR产物送上海生物工程有限公司测序。

表1 试验中的引物信息

1.4 基因序列分析和进化树构建

采用ORF Finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)鉴定的开放阅读框和氨基酸序列；采用Compute pI/Mw(https：//web.expasy.org/compute_pi/)鉴定分子量和等电点；利用NCBI CDD(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)鉴定HIP的保守结构域；使用MEGA 5.1中的临接法(NJ)构建系统发育树，Bootstrap取样值设置为1 000次。

1.5 MsHIP的时空表达分析

1.5.1 样品收集 收集黏虫不同发育阶段(包括卵、1～6龄幼虫、蛹和4日龄雌成虫)和4日龄雌成虫不同组织(头、胸部、触角、翅、中肠、脂肪体和卵巢)样品，立刻用液氮速冻，存于-80 ℃下，用于总RNA的提取。每个样品重复4次。

1.5.2 Real-time PCR分析 基于基因序列设计特异性引物，以和为内参基因，并以不同发育阶段和不同组织样品的cDNA为模板，在CFX-96 PCR仪(Bio-Rad，USA)进行qRT-PCR。PCR反应体系为20 μL，包括SsoAdvancedUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad) 10 μL，上下游引物各1 μL(表1)，模板cDNA 1 μL，ddHO 7 μL。qRT-PCR程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，退火温度下 30 s，共35个循环，反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线。采用2-ΔΔ法计算黏虫在不同发育阶段和不同组织中的相对表达量。每个样品含4个生物学重复，每个生物学重复含3个技术重复。

1.6 数据分析

所有表达量数据表示为平均值±标准误。采用DPS 17.0中的单因素方差分析法(One-Way ANOVA)分别分析不同发育时期和不同组织处理表达量间的差异显著性(=0.05)。

2 结果与分析

2.1 MsHIP的序列特征分析

通过RT-PCR获得的序列全长为1 215 bp，命名为，GenBank登录号为OK474875。编码405个氨基酸(aa)，预测的分子量为44.04 ku，等电点为4.93。采用NCBI中的保守结构域搜索发现，中存在昆虫HIP的3个保守结构域，分别是1个位于N-端的二聚体结构域(7～47 aa)，1个TPR结构域(TPR1，123～156 aa，TPR2，157～190 aa，TPR3，191～224 aa)和1个位于C-端的U-box结构域(图1)。多序列比对分析发现，夜蛾科昆虫的HIP结构比较保守，均具有定义HIP蛋白的3个保守结构域(图1)。

2.2 鳞翅目昆虫HIP系统发育分析

通过NCBI搜索比对，发现黏虫的HIP氨基酸序列与棉铃虫()的 HIP 氨基酸序列相似度最高，为86.62%，其次为草地贪夜蛾()(86.54%)和斜纹夜蛾()(85.34%)，与粉纹夜蛾()的相似度为82.57%。系统发育树分析显示，该系统树被明显分为2支，即鳞翅目和双翅目。在鳞翅目夜蛾科中，黏虫HIP与棉铃虫HIP的亲缘关系最近，以较高的支持率(66.00%)聚在一起(图2)。

2.3 MsHIP时空表达分析

在黏虫各发育阶段的表达差异显著(=5260，=8，35，<0.001)。其中，以4日龄成虫的表达量最高，是对照(卵)的45.28倍；其次为6龄幼虫，表达量是对照的36.90倍；在其余发育阶段的表达量较低，均与对照相比差异不显著(图3-A)。

在4日龄成虫不同组织中表达差异显著(=3052，=6，27，<0.001)。其中，在卵巢中的表达水平最高，是对照(头)的18.55倍；其次为脂肪体，其表达水平是对照的13.58倍；在胸、触角、翅和中肠中表达水平较低，与对照相比差异不显著。

3 结论与讨论

HSPs作为分子伴侣在调控昆虫生殖中的作用已得到证实。本研究基于前期的转录组数据分析，结合RT-PCR获得的全长序列，是GenBank中登录的第24个昆虫的HIP序列。同已报道的HIP一样，MsHIP含有3大保守结构域，即二聚体结构域、TPR结构域和U-box结构域。N-端的二聚体结构域的主要功能是作为一种调控因子调控HSP70的功能；TPR是由34个氨基酸组成的多肽，其功能主要是直接与HSP/HSC70和HSP90 中ATPase 结构域结合，减缓ADP的释放速度；U-box具有E3泛素化抑制剂连接酶和多聚泛素化链延伸活力，有助于加速依赖泛素化的分子伴侣基质的降解。基于鳞翅目昆虫HIP的系统发育分析显示，黏虫主要与斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、粉纹夜蛾和棉铃虫聚在一起，且与棉铃虫的亲缘关系最近，支持率高达66.00%，同属夜蛾科。这几种昆虫HIP的分子结构、氨基酸相似度(82.57%～86.62%)及田间多食性特点都佐证了以上结论，表明他们可能来源于同一祖先，因自然选择压力而发生分化。

HSPs的表达具有发育阶段和组织特性。本研究发现，在所有发育时期均表达，但其在不同时期的表达模式存在差异，这与已报道的其他昆虫的HSPs的表达规律不一致。例如，赤拟谷盗在蛹早期和成虫早期的表达量最高；褐飞虱、、、和在成虫中的表达水平最高，则在5龄幼虫中表达量最高，而和在所测试的发育阶段表达量都很低；对三叶斑潜蝇()而言，在所有发育阶段的表达十分恒定，在蛹和成虫中高表达，而则只在雌成虫中高表达。在黏虫中，在2龄和6龄幼虫中高表达，则在黏虫1 龄幼虫中高表达，而在6龄幼虫和4日龄雌成虫高表达。这些结果说明，不同的HSPs在不同物种的生长发育过程中发挥不同的作用。此外，研究发现在4日龄雌成虫中高表达的现象与黏虫卵黄原蛋白受体基因()和脂蛋白受体基因()(另文发表)的表达规律基本一致，表明可能参与黏虫的生殖。

为进一步明确该基因是否在黏虫的生殖中发挥作用，进一步检测了其在成虫不同组织中的表达情况。结果显示，在卵巢和脂肪体中高表达，这与棉铃虫、大螟和草地贪夜蛾在不同组织中的表达规律不一致，但与褐飞虱中、、、的表达规律类似。和在昆虫的生殖中发挥重要作用，其中脂肪体是卵黄原蛋白合成的主要场所，而卵巢则是卵母细胞发育的主要场所。李杰研究发现，在黏虫脂肪体和卵巢中高表达，采用RNAi沉默该基因后，其在脂肪体和卵巢中的表达水平显著降低，同时卵的发育畸形，产卵量显著减少，从而证明了在黏虫的生殖中发挥重要作用。基于与在黏虫雌虫生殖器官中表达规律的一致性，因此推测在黏虫的生殖中也发挥重要作用。

综上，本研究首次从黏虫中克隆了基因，发现具有昆虫定义的3个保守结构域，并且在黏虫的雌成虫及脂肪体和卵巢中高表达，表明其在黏虫生殖中具有重要作用。