聚氨酯创面敷料的细菌内毒素检查法

徐红梅，李发家，王亮

（1.苏州凯瑞斯生物科技有限公司，江苏 张家港 215600；2.江苏艾迪尔医疗科技股份有限公司，江苏 张家港 215600）

聚氨酯（PU）创面敷料具有材质柔软，孔径大小均匀，吸湿透气高吸收性等优点，其多孔层状的结构有利于排出创面产生的分泌物，能够抵御外界细菌的侵入，防止创面受到细菌的感染，促进伤口在一个相对湿润的微环境中快速愈合［1-3］；另外因其具有良好的韧性和弹性、加工性能好、加工方式多样等优点，被广泛应用于溃疡创面、创伤创面等方面的治疗［4-5］，在临床上对于急性创面、慢性难愈合创面及外科手术后渗出液较多的创面等情况，聚氨酯创面敷料多与负压吸引装置联合使用，能够加快创面的愈合，大大减少感染的概率，在临床上得到广泛的使用［6］。

细菌内毒素检测是食品、生物医药、医疗器械等行业必不可少的安全检测手段［7-8］。如若创面敷料的细菌内毒素含量超标轻则会引起机体的发热，重则当细菌内毒素在进入人体血液中的浓度足够大时会引起更严重的安全问题，如败血症性休克，从而导致死亡。因此为了避免创面敷料在生产过程中引入的质量风险，保证产品在实际使用中的安全性，有必要对其细菌内毒素的含量进行严格控制。查阅相关标准可知［9-10］，目前细菌内毒素检查方法主要分为凝胶法和光度法［11-12］。最常用的检测方法是凝胶法，鲎试剂中的凝固酶和凝固蛋白原能够被微量的细菌内毒素激活，其中凝固酶被激活转化成具有活性的凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原转变成凝固蛋白而最终形成凝胶，这便是细菌内毒素检查法（凝胶法）的作用机理［13］。该文采用凝胶法对聚氨酯创面敷料进行细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，为不同规格型号的该产品的细菌内毒素检查提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究所使用的材料与试剂见表1。

表1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

研究所使用的仪器与设备见表2。

表2 仪器与设备

1.3 试验方法

1.3.1 器具处理 试验过程中所用到的所有玻璃器皿需为耐高温材质制成，全部清洗干净之后放入洁净的不锈钢灭菌盒内，经过250℃烘烤1 h 除去可能存在的外源性内毒素，避免试验过程假阳性的现象出现。如若使用非金属以及不耐高温玻璃材质的器具，应该选用对试验过程无干扰的标明无内毒素的器具，如微孔板和吸头等。

1.3.2 细菌内毒素限值（L）的确定 根据YY/T0618 标准［14］，对于医疗器械而言，每件器械内毒素限值K＜20 EU，取3 批聚氨酯创面敷料（Y2004006、Y2004013、Y2004028），根据创面敷料的规格（300×200×30）mm 设定每件的冲洗液总量V 为600 mL，根据公式，试验液内毒素限值=KN/V，计算可得在该冲洗量的情况下该规格的聚氨酯创面敷料的试验液内毒素限值为0.033 EU/mL，以此限度进行聚氨酯创面敷料的细菌内毒素方法研究。

1.3.3 聚氨酯创面敷料最大有效稀释倍数（MVD）的确定 根据公式：MVD=CL/λ，其中L 为聚氨酯创面敷料的试验内毒素限值0.033 EU/mL，C 为聚氨酯创面敷料浸提液的浓度，即为1.0 mL/mL，λ为鲎试剂的标示灵敏度，此次试验采用两种厂家生产的灵敏度均为0.03 EU/mL 的鲎试剂，则该规格的聚氨酯创面敷料试验液的最大有效稀释倍数（MVD）为1 倍，即为该供试品600 mL 浸提液原液。

2 结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核

根据2020 版《中华人民共和国药典》［10］中的细菌内毒素检查法，对两种厂家生产的灵敏度均为0.03 EU/mL 的鲎试剂进行灵敏度复核试验。具体试验结果见表3，结果显示两种生产厂家生产的标示灵敏度λ 为0.03 EU/mL 的鲎试剂的λc分别是0.025 EU/mL 和0.03 EU/mL，均在0.5 λ～2 λ 之间，均符合要求，即可证明这两种鲎试剂均可用于供试品的干扰试验和供试品细菌内毒素检查试验。

表3 鲎试剂灵敏度复核试验结果

2.2 干扰试验

干扰试验目的是为了验证供试品在一定浓度或者一定量的浸提液中，鲎试剂与内毒素的凝胶反应是否受到干扰［15］。当鲎试剂或者供试品的生产厂家、配方、生产工艺以及试验环境等发生了其他有可能影响试验结果的变化时，需要重新做干扰试验。本实验分别将3 批的聚氨酯创面敷料置无热原玻璃器皿或者无热原取样袋内，分别加600 mL BET 水振摇数次，在（37±1）℃恒温箱中浸泡浸提不少于1 h，即得聚氨酯创面敷料浸提液，供试品的浸提液贮存周期应≤2 h，本次试验分别采用符合上述灵敏度复核试验的两种生产厂家的0.03 EU/mL 鲎试剂进行干扰试验。具体试验结果见表4。结果表明，3 批聚氨酯创面敷料的浸提液对这两种鲎试剂生产厂家生产的0.03 EU/mL 的鲎试剂与细菌内毒素的反应均不存在干扰作用，均不影响其凝胶反应，即ES均在0.5 λ～2 λ 之间，Et均在0.5 ES～2 ES之间，则证明可在该600 mL 浸提液下对此供试品进行细菌内毒素检查，结果均符合要求。

表4 聚氨酯创面敷料的干扰试验结果

2.3 供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验

用这两种鲎试剂分别对3 个批次的聚氨酯创面敷料的浸提液进行细菌内毒素检查，具体检测结果见表5。结果表明，用0.03 EU/mL 灵敏度的鲎试剂进行细菌内毒素检查，3 批聚氨酯创面敷料的浸提液的细菌内毒素检查结果均符合要求，即可证明该3 批创面敷料的浸提液试验内毒素含量小于0.033 EU/mL，聚氨酯创面敷料的细菌内毒素含量小于20 EU/件，符合要求。

表5 聚氨酯创面敷料细菌内毒素检查结果

3 讨论

本研究采用首先对两种不同厂家生产的鲎试剂（0.03 EU/mL）的灵敏度分别进行复核试验，然后对3 批聚氨酯创面敷料（300 mm×200 mm×30 mm）的干扰试验及细菌内毒素凝胶限度进行试验，建立了聚氨酯创面敷料的细菌内毒素检查法。鲎试剂灵敏度复核试验结果证明两种不同厂家生产的鲎试剂（0.03 EU/mL）的灵敏度复核试验结果均符合规定；然后分别采用这两种0.03 EU/mL 的鲎试剂对3 批聚氨酯创面敷料进行干扰试验，试验结果证明该规格的聚氨酯创面敷料在600 mL 的冲洗量的情况下对鲎试剂反应无干扰作用，确定所采用的方法可行；再对该试验条件下的3 批聚氨酯创面敷料进行细菌内毒素检测，结果均符合规定。证明该检测方法适用于聚氨酯创面敷料的细菌内毒素检测，具有可行性。对于不同规格的聚氨酯创面敷料应根据实际情况确定冲洗量，继而确定试验内毒素限值。