生物标志物ADH1C、PCK1、MARCO在急性阑尾炎诊断中的作用
2022-07-28史伟山王定一廖新伟
史伟山，王定一，廖新伟
（1.泌阳白云山中西医结合医院 普外科，河南 驻马店 463700；2.驻马店市中心医院 普外科，河南 驻马店 463000）
急性阑尾炎是引起腹痛的最常见原因之一，国内每年有近75 万次急诊和25 万次阑尾切除术。在全球范围内，小部分手术是“阴性阑尾切除术”，因误诊导致切除非发炎的阑尾［1］。目前CT扫描是诊断阑尾炎的“金标准”，对孕妇来讲，磁共振成像（MRI）可作为合理的替代检查，而超声波检查可作为初步诊断的替代检查［2-3］。虽然CT扫描是阑尾炎最敏感和最特异的诊断工具，但具有显著的辐射暴露问题，在儿童群体中尤其值得关注，因为他们更容易受到辐射暴露的影响。［4］。为减少CT 扫描的损害，几个临床试验正在检验低剂量辐射的诊断效用［5-6］。而关于血液生物标志物对急性阑尾炎的诊断相关的研究较少，本研究为找到急性阑尾炎的血液生物标志物，分析了阑尾炎患者和非炎症腹痛患者的微阵列图谱。为验证这些生物标志物在急性阑尾炎患者诊断中的作用，本文对急诊室腹痛患者的血液样本进行了蛋白表达水平的检测，以期将使用血液生物标志物作为一种急性阑尾炎预筛选方法成为可能。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2020 年1 月至2021 年6 月在泌阳白云山中西医结合医院急诊科住院的80 例腹痛患者作为研究对象。其中最终确诊为急性阑尾炎的患者46 例为阑尾组，其他原因腹痛的患者34 例为对照组。阑尾组男23 例，女23 例；年龄18～67 岁，平均（43.37±15.25）岁；体质量指数（BMI）（22.15±1.25）；血白细胞计数（10.6±1.52）×109/L；长期吸烟者23 例。对照组男17 例，女17 例；年龄18～65 岁，平均（43.46±15.83）岁；BMI（22.32±1.23）；血白细胞计数（10.8±1.48）×109/L；长期吸烟者17 例。两组基线资料如性别、年龄、BMI、血白细胞计数及吸烟情况等比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。该临床研究符合赫尔辛基宣言，并通过医院伦理审查。
1.2 纳入排除标准
纳入标准：①正在接受急性腹痛评估的患者，包括阑尾炎或疑似肠炎和/或缺血；②阑尾组患者最终由手术及病理证实为急性阑尾炎；③年龄大于18 岁。排除标准：①病危的患者；②导致腹痛的全身恶性疾病患者；③孕妇。
1.3 方法
1.3.1 差异性基因表达 GSE9579 阵列的心脏基因表达谱和相关临床数据可从Gene Expression Omnibus（GEO,https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载。从诊断为急性阑尾炎的患者中取出的9 个阑尾样本和因非炎症原因取出的4 个样本中评估了基因表达［7］，在每个样本的远端获得一块圆周组织，根据基因表达谱筛选候选因子；使用Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array 微阵列测量基因表达。另外，根据以下标准筛选差异表达的蛋白质|logFC|＞1 和adj.P＜0.001。
1.3.2 基因富集分析 KEGG 富集分析使用"clusterProfiler"R 包对上述差异基因进行通路富集分析。
1.3.3 蛋白-蛋白互作网络（PPI）使用在线STRING 对差异基因进行PPI 分析，并将其可视化，然后使用R 语言进行节点分析。
1.3.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）①主要试剂：人ADH1C-ELISA 试剂盒购自上海斯信生物科技有限公司，PCK1-ELISA 试剂盒购自上海双赢生物科技有限公司，MARCO-ELISA 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。②主要仪器：离心机（济南江雪医疗器械有限公司），恒温箱（北京福意电器有限公司），酶标仪（济南贝思网络技术有限公司）。③实验方法：采集所有研究对象的空腹静脉血，静置分层后，4℃低温离心机中以3 000 r/min 离心10 min，上层即为血清；根据相应的ELISA 试剂盒说明书测定各组患者血清中酒精脱氢酶1C（ADH1C）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）、胶原结构巨噬细胞受体（MARCO）的含量。
1.4 观察指标
所有患者均于入组后次日清晨8:00—9:00 空腹状态下抽取外周静脉血，通过ELISA 法检测血清中ADH1C、PCK1、MARCO 的水平。
检验效能采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析，ROC 曲线用于选择最佳诊断界限值，曲线越靠近左上角，准确性越高。本研究只展现曲线下面积（area under curve,AUC），其用于判断各检测指标的诊断效能：AUC＞0.9，为诊断准确性优；0.9＞AUC＞0.7，为诊断准确性良好；0.7＞AUC＞0.5，为诊断准确性差；0.5＞AUC，为诊断准确性无临床意义。
1.5 统计学方法
使用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料以（）表示，行t检验；计数资料以百分率（%）表示，行χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 基因表达谱筛选候选因子
从GSE25765 数据集中，进行阑尾炎组与对照组的差异性基因表达，结果发现ADH1C、PCK1显著下调，而MARCO 显著上调，见图1A。图1B显示了利用热图将差异基因在每个样本中表达水平的矩阵。
图1 基因表达谱筛选候选因子
2.2 差异表达基因的相关功能
KEGG 富集分析发现这些差异基因参与P450-药物代谢、酪氨酸代谢、丙酮酸代谢、类固醇激素生物合成及PPAR 信号通路等生物学功能。此外，利用在线string 工具可视化上述差异基因间的蛋白-蛋白互相作用网络（protein-protein interaction network,PPI），其中ADH1C 与其它蛋白节点间的连线最多，ADH1C 的中心性最高，提示与其它蛋白联系紧密，见图2。
图2 差异表达基因的相关功能
2.3 两组患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO含量的比较
与对照组相比，阑尾组患者血清中ADH1C、PCK1 含量显著均较低，MARCO 含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
表1 两组患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO 含量比较（n=40,）
表1 两组患者血清中ADH1C、PCK1、MARCO 含量比较（n=40,）
2.4 各检测指标对急性阑尾炎的诊断性能
血清ADH1C、PCK1、MARCO 水平对急性阑尾炎分别具有良好的诊断性能（AUC 值＞0.07），见表2。
表2 各检测指标对急性阑尾炎的诊断性能
3 讨论
阑尾炎是一种炎症性疾病，类似于憩室炎或结肠炎，但某些血液生物标志物的激活是不同的［8］。血液中蛋白的变化模式有助于更好的从生物标志物层面理解急性阑尾炎的病因，有研究认为微生物组16S 区的下一代测序（NGS），充分表明了梭杆菌的变化与阑尾炎有关［9］。梭杆菌是一种革兰氏阴性细菌，可以通过产生丁酸（丁酸盐）而引起邻近宿主细胞的毒性反应和小鼠的结肠炎样症状。也有研究试图开发血液中阑尾炎的蛋白质生物标志物，如胆红素、C-反应蛋白（CRP）和降钙素原（PCT）等。然而对这些生物标志物的研究难以找到理想的临床预测模型。WBC，CRP 和MRP8/14（S100A8/S100A9）的组合显示对急性阑尾炎的敏感度为96%，但特异度为43%［10］。同样，在急性阑尾炎中，由血清淀粉样蛋白（SAA），髓过氧化物酶（MPO）和MMP9 血浆蛋白水平建立的多变量模型的诊断率低于主要临床模型（ROC=0.71vs.0.91 临床模型）［11］。本研究前期通过分析阑尾炎GEO 芯片，发现表达异常的基因ADH1C、PCK1、MARCO，可能是阑尾炎的潜在生物标志物。
本研究发现血清ADH1C、PCK1 水平在急性阑尾炎患者中呈现上调的趋势，且具有一定的诊断价值。这与ADH1C 是溃疡性结肠炎最显著下调的差异性表达基因（DEGs），并且ADH1C 的过表达可以明显减少白细胞介素（IL）-6 和IL8 产生的结论较为一致［12］，可能为治疗溃疡性结肠炎的潜在靶点。肠道血管屏障（gut-vascular barrier,GVB）的高渗透性在肠道源性败血症中起作用，而PCK1在改善GVB 的机制中起重要作用［13］。与我们的研究结果基本一致，PCK1 的下调会导致肠道血管屏障的失调，从而导致阑尾炎症的发生。
有研究证实证实肺部炎症组织中MARCO 水平升高［14］。MARCO 作为跨膜受体，除了吞噬作用外，还是一种粘附质膜受体，它可通过巨胞饮和内吞途径将各种细胞外物质掺入细胞中发挥作用［15］。此外，靶向肺癌中免疫抑制性巨噬细胞的MARCO 和IL37R 可阻断调节性T 细胞并支持细胞毒性淋巴细胞功能［16］。巨噬细胞被吸引到黏膜炎症部位，是正常维持屏障功能的主要组成部分，它们对肠道微环境中的各种可溶性信号有反应，包括缺氧［17］。
目前在市场上用于乳腺癌进展［70 基因预测标记（MammaPrint，Agendia，荷兰），21 基因复发评分（Oncotype DX，美国）］、移植排斥反应（AlloMap，美国）和冠状动脉疾病（CorusCAD）的生物标志物测试产品较多，本研究同样评估了血液潜在生物标志物对阑尾炎的诊断效能，认为尽管蛋白质生物标志物会由于其他高丰度蛋白质的干扰而难以测量，但相对于mRNA 标志物来说，其检测相对较快、易于应用于临床，因而仍然具有开发价值。
综上所述，阑尾细菌生物膜可能是阑尾炎的一个重要病理生理机制，ADH1C、PCK1、MARCO在急性阑尾炎患者中变化显著，对急性阑尾炎的临床诊断具有一定指导意义。
