当归注射液对肝硬化大鼠门静脉压力及TGFβ1/PI3K通路的调节作用*

肝硬化是常见的消化系统疾病之一，作为一种慢性进行性肝病，如不及时干预其会发展为肝肾综合征、肝性脑病、肝癌等

。目前临床对于肝硬化的治疗通常采用保肝、降低门脉压力等对症治疗，只能缓解肝硬化的疾病进展，所以对于肝硬化治疗药物的研发仍是目前临床的迫切需求。现代医学研究表明，TGF-β1/PI3K通路是与肝硬化疾病进展密切相关的信号通路，该通路相关蛋白的异常激活导致肝硬化疾病恶化加速

。当归作为一种补血活血的传统中药，其对于肝硬化的治疗作用近年来逐渐被发现，研究发现当归能够明显修复大鼠肝功能，对肝硬化进展及预后具有一定的效果

。本实验通过研究当归注射液对肝硬化大鼠门静脉及TGF-β1/PI3K通路的调节作用，为当归注射液在肝硬化治疗中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠72只，雄性，6～8周龄，体重180～200 g，购自锦州医科大学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK(辽)2017-0003，于动物房饲养1周后进行实验。

1.2 药品及试剂 当归注射液(福建古田药业有限公司，批号201806221，规格2 ml，浓度0.1 g/ml)；水飞蓟素(德国马博士大药厂，批号10291103)；ALT、AST ELISA试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司，货号CSB-E13024r-1、CSB-E13023r-1)；PI3K、p-PI3K及TGF-β1兔多克隆抗体、GAPDH兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(碧云天生物科技有限公司，货号AF7742、AF5905、AF0297、AF1186、A0208)；总RNA抽提试剂盒、cDNA合成试剂盒、PCR反应试剂盒、高效RIPA裂解液、ECL Plus超敏发光液、HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号R1200、T2240、SR1110、R0010、PE0010、G1120)；PCR引物设计及合成由赛默飞世尔科技有限公司完成。

1.3 仪器与设备 CX31荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯)；Omega Fluor 凝胶成像系统凝胶成像仪(美国Aplegen公司)；Sigma8K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；C1000梯度PCR仪(美国bio-rad公司)；Multiskan Sky全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司)；RM2235石蜡切片机(德国Leica公司)；压力传感器(上海艾尔科特生物科技有限公司)。

1.4 大鼠分组及造模处理 72只大鼠随机分为对照组、肝硬化组、当归注射液低、中、高剂量组及水飞蓟素组，12只/组，除对照组外，其余各组大鼠按照5 ml/kg腹腔注射给予大鼠体积分数为20%的CCl

大豆油溶液

，2次/周，连续7周，对照组大鼠腹腔注射大豆油溶液。造模结束后，随机取3只大鼠进行肝组织病理形态学观察，以大鼠肝组织细胞坏死、炎症浸润、大量胶原沉积视为造模成功。当归注射液低、中、高剂量组大鼠分别按照3 ml/kg、6 ml/kg、12 ml/kg

腹腔注射给予当归注射液，水飞蓟素组大鼠给予30 mg/kg的水飞蓟素腹腔注射

，对照组及肝硬化组大鼠给予生理盐水腹腔注射。各组大鼠均1次/d，连续4周

。

1.5 大鼠血清ALT、AST水平测定 大鼠眼眶取血，于4℃静置1 h，离心取上清，使用ALT、AST ELISA试剂盒测定大鼠血清ALT、AST水平。

1.6 大鼠门静脉压力及血流量的测定 大鼠禁食24 h后，使用戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉后，参考文献方法[10]测定大鼠门静脉压力及门静脉血流量。

1.7 大鼠肝、脾指数的计算 大鼠称重后处死，分离肝、脾组织，按照以下公式计算大鼠肝、脾指数。肝指数=肝组织重量(mg)/体重(g)，脾指数=脾组织重量(mg)/体重(g)。

1.8 大鼠肝组织病理学检查 大鼠处死后立即取出肝组织，肝组织用10%中性甲醛固定后，石蜡包埋，制成5 μm切片，进行常规HE染色，在光学显微镜下进行组织病理学观察。

2.4 当归注射液对肝硬化大鼠肝组织病理形态的影响 当归注射液对肝硬化大鼠肝组织病理形态的影响如图1所示。结果表明，对照组大鼠肝组织结构正常，未见明显病理性改变；与对照组比较，肝硬化组大鼠肝组织细胞坏死、炎症细胞浸润，胶原沉积增多，提示造模成功；与肝硬化组大鼠比较，当归注射液低、中、高剂量组及水飞蓟素组大鼠肝组织病理性明显改善。

1.11 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，各项指标结果符合正态分布，以均值±标准差的形式表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，

<0.05表示差异有统计学意义。

2.2 当归注射液对肝硬化大鼠门静脉压力、门静脉血流量、内脏血管阻力的影响 见表2。

站在医院发展层面，脑血管病在省内和国内均是被十分看重的项目。其中，河南省正在打造建设6个国家区域医疗中心，其中脑血管病区域医疗中心是其中之一。而在2017年，脑血管疾病也被定义为国家发改委疑难危重能力提升工程的重点项目。

2.1 当归注射液对肝硬化大鼠血清ALT、AST的影响 见表1。

1.10 大鼠肝组织PI3K及TGF-β1蛋白表达测定 取大鼠肝组织加入RIPA裂解液，研磨匀浆后离心，取上清液煮沸变性，测定总蛋白含量，各组取等量蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到聚偏二氟乙烯膜上，封液封闭后，用PI3K、p-PI3K及TGF-β1兔多克隆抗体和山羊抗兔IgG二抗孵育，滴加显影液，使用凝胶成像系统拍照，ImageJ进行定量分析。

2 结果

(3)车轮旋转的上述效应更多来自轮轨力相对车轮的旋转，在陀螺效应也是很明显的，如图8所示。图8中示出了3条曲线，实线是车轮不旋转时的动柔度，虚线是车轮以400 km/h旋转时的动柔度，而点线是令陀螺矩阵G=0所得到的动柔度。可以看出，当陀螺矩阵G=0时，频率分解有的加宽有的变窄了，但峰值的高度改变不是特别大。

测区位于内蒙古准格尔旗黄河边上，沟壑纵横，植被覆盖较少，为典型的黄土地貌。项目要求地形图比例尺为1∶2 000，等高距为2 m[1-2]，用于矿山地质灾害治理。整个测区面积合计24.7 km2，分布在5个治理区域。测区内主要地物为：在建高架铁路、普通工业厂房及居民地、网围栏、公路及大车路、电杆(塔)、光缆桩、路堤、路堑和田坎，主要植被为耕地、零散树木及成片的果园。测区最低海拔为870 m，最高海拔为1 346 m，最大高差达476 m。

反转教学模式充分体现了以学生为主体，教师为主导的教学理念，因此在该模式下学习，能够激发学生的自主学习兴趣，培养学生更具社会化，并且有终身学习意识等。

2.3 当归注射液对肝硬化大鼠肝、脾指数的影响 见表3。

1.9 大鼠肝组织PI3K及TGF-β1 mRNA测定 取大鼠肝组织匀浆液，使用RNA提取试剂盒从组织匀浆中提取总RNA，提取后将总RNA逆转录为cDNA，利用PCR反应试剂盒测定并计算PI3K及TGF-β1 mRNA表达量，以GAPDH为内参，采用2

法计算相对表达量。引物序列为GAPDH:正向引物：5'-GCAGGAGTACGATGAGTCCG-3'，反向引物：5'-ACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3'；PI3K：正向引物：5'-GAGGAACTGCATTGGGAAAC-3'，反向引物：5'-TGGGATCTGGCAGTAGCTC-3'；TGF-β1：正向引物：5'-TACGCATACCTGAAAGGCAC-3'，反向引物：5'-GGACTTCACACAATGCCCAGT-3'。

2.5 当归注射液对肝硬化大鼠肝组织PI3K及TGF-β1 mRNA的影响 见表4。

2.6 当归注射液对肝硬化大鼠PI3K及TGF-β1蛋白表达的影响 见表5及图2。

3 讨论

肝硬化是由于病毒感染、酒精中毒、循环障碍等多种原因引起肝组织细胞损伤后导致肝细胞结节性再生、结缔组织增生、肝纤维化等病理性改变。门静脉高压大多数是由于肝硬化病理进展过程中引起的并发症，主要原因是由于静脉血流不能经过肝脏进入下腔静脉，进而导致门静脉压力持续增高。长期的门静脉高压会导致食管胃底静脉曲张、脾脏肿大、脾功能亢进、腹水等一系列并发症

。目前临床对于肝硬化及门静脉高压的治疗多采用对症治疗及支持治疗以减缓肝硬化的疾病进展，水飞蓟素是近年来研究表明能够明显抑制肝硬化及肝纤维化进展的药物，所以本实验选用水飞蓟素作为阳性对照药。

当归作为一种传统中药，来源于伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，其味甘，性温，归肝、心、脾经，具有活血通便、调经止痛等功效，用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调等病症。现代研究发现当归具有抗炎、抗氧化损伤等药理作用

，同时对脑血管损伤

及血脑屏障损伤

具有明显的修复及保护作用。早期黄自平等人

通过临床研究发现肝硬化门脉高压患者输注当归注射液后，患者门静脉压力及血流量均明显减轻，且患者未出现全身不良反应；李校天等

研究报道了肝硬化患者口服当归治疗后，患者肝功能明显恢复且患者门静脉及脾静脉压力降低。近年来研究报道了当归补血汤及当归芍药汤等中药汤剂均能够明显降低肝硬化患者ALT、AST水平，修复患者肝功能，调节肝硬化患者门静脉血流动力学改变，降低腹水的发生及进展。

我国传统节日内涵丰富，是践行和培育社会主义核心价值观的宝贵资源。学校可深入挖掘传统节日的内涵，创新开展形式各异的践行活动。清明节组织全校师生走进中国工农红军西路军纪念馆，举行“重温革命历史，缅怀革命英烈”扫墓活动；端午节通过开展“包粽子比赛”“屈原诗词朗诵比赛”等活动进一步增强爱国爱乡情感；中秋节举行“图说我家的中秋节”电子手抄报比赛，通过丰富的图片解说，引导孩子们体会阖家团圆、国泰民安的喜悦……

其作用是防治地下害虫，如蝼蛄、蛴螬、金针虫等。方法是将 “菌虫必杀”药剂每亩用5袋（400 g/袋），拌细土均匀撒入播种沟内。

ALT、AST是反映肝损伤的常用指标，ALT、AST水平升高提示肝组织细胞损伤，肝功能降低；肝脾指数是反映肝、脾组织水肿状态的指标，杨牧祥

研究表明肝硬化大鼠肝、脾组织处于水肿状态，肝脾指数明显升高。门静脉压力及门静脉血流量是反映肝门静脉血流动力学的重要指标，张成刚等

研究表明门静脉压力升高及血流量增加是肝硬化门静脉血流动力学变化及门静脉压力异常的重要原因。本实验研究表明，与肝硬化组大鼠比较，当归注射液各剂量组大鼠血清ALT、AST水平、肝脾指数、门静脉压力及门静脉血流量降低，提示当归注射液能够呈剂量依赖性的改善大鼠肝功能及门静脉血流动力学改变。

研究证实TGF-β1通路的过度激活是导致肝星状细胞激活，进而诱导肝细胞外基质过度沉积的重要原因

。PI3K通路能够促进细胞的增殖、分化及转移，近年来研究发现PI3K通路的过度激活是肝硬化向肝细胞癌癌前恶变的重要机制之一

。过度激活的PI3K能够通过抑制细胞凋亡、改变细胞周期、增强肝细胞癌上皮细胞的迁移和侵袭能力。冯雪等

研究发现CCl

诱导的肝硬化小鼠肝组织TGF-β1表达升高，抑制TGF-β1的过表达，能够改善小鼠肝功能，缓解小鼠肝硬化进展；吴灿等

研究表明TGF-β1/PI3K通路的过度激活是肝硬化病理进展重要原因之一，而丹参多酚酸盐能够通过抑制TGF-β1/PI3K通路进而抑制大鼠肝硬化的进一步恶化。本实验结果表明，与肝硬化组大鼠比较，当归注射液各剂量组大鼠肝组织p-PI3K/PI3K及TGF-β1水平降低，且随着当归注射液剂量的增加，肝组织p-PI3K/PI3K及TGF-β1水平逐渐降低，即当归注射液能够呈剂量依赖性的抑制肝硬化大鼠肝组织TGF-β1/PI3K通路的过表达，进而抑制大鼠肝硬化的进展。

综上所述，当归注射液能够抑制肝硬化大鼠肝组织TGF-β1/PI3K通路的过表达，降低门静脉压力，调节门静脉血流动力学改变。

[1]Barnett R.Liver cirrhosis[J].Lancet，2018，392(10144):275.

[2]Lei Y,Wang QL,Shen L,

.Microrna-101 suppresses liver fibrosis by downregulating pi3k/akt/mtor signaling pathway[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol，2019，43(5):575-584.

[3]Wu L,Zhang Q,Mo W,

.Quercetin prevents hepatic fibrosis by inhibiting hepatic stellate cell activation and reducing autophagy via the tgf-β1/smads and pi3k/akt pathways[J].Sci Rep，2017，7(1):9289.

[4]李渊.肝硬化顽固性腹水患者采取十枣汤联合当归补血汤治疗的临床价值[J].中外医学研究,2020,18(5):136-138.

[5]郭涛,赵志敏,杨烁慧,等.当归补血汤及其拆方影响肝脏血管新生的药效特点及作用机制[J].临床肝胆病杂志,2014，4:324-329.

[6]冯雪,李毅,陈谭昇,等.吡菲尼酮抑制TGF-β/Smad信号通路缓解四氯化碳诱导的小鼠肝硬化[J].中国免疫学杂志,2019,35(2):161-164.

[7]孙先军,陶梦婕,邓文丽,等.当归注射液对大鼠慢性肺动脉高压的影响[J].中国小儿急救医学,2011,3:249-251.

[8]景晶,赵金英,华冰,等.甘草总黄酮抑制硫代乙酰胺诱导肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1及Caspase-3的表达[J].中国中药杂志,2015,40(15):3034-3040.

[9]沈海容,黄应武,王大东,等.美洲大蠊提取物对肝硬化门静脉高压大鼠门静脉压力及巨噬细胞移动抑制因子表达的影响[J].广西医学,2018,40(17):1972-1974.

[10]刘琦,李坚,关晓东,等.入肝门静脉动脉化加门腔分流术对肝硬化大鼠血流动力学的影响[J].中华普通外科学文献(电子版),2010,4(2):109-113.

[11]Romanelli RG,Stasi C.Recent advancements in diagnosis and therapy of liver cirrhosis[J].Curr Drug Targets，2016，17(15):1804-1817.

[12]刘汝银,彭晓艳,岳宗进,等.当归对大鼠椎间盘髓核细胞自噬及氧化应激损伤的作用及机制研究[J].中国脊柱脊髓杂志,2018,28(2):176-182.

[13]齐若,周晓利,顾志敏,等.当归多糖对青光眼大鼠视网膜神经细胞的保护作用及其机制[J].吉林大学学报(医学版),2018,1(44):117-121.

[14]赵玉青,刘振权,白雪,等.复方当归注射液对拟缺血损伤大鼠脑微血管内皮细胞的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2018,16(8):1015-1017.

[15]宋颢,章军建.当归对慢性脑低灌注大鼠血脑屏障的保护作用[J].武汉大学学报(医学版),2020,41(5):54-57.

[16]杨牧祥,张一昕,王少贤,等.柔肝消癥饮对肝硬化大鼠肝功能的影响[J].中医药通报,2007,6(3):57-57.

[17]张成刚,张斌,闫凛,等.雌激素受体β激动剂对肝硬化门静脉高压大鼠高动力循环的调节作用及其机制[J].中华肝胆外科杂志,2020,4:295-299.

[18]Colak S,Ten Dijke P.Targeting tgf-β signaling in cancer[J].Trends Cancer，2017，3(1):56-71.

[19]鞠迪,李京涛,韩曼,等.肝星状细胞通过TGFβ1-PI3K/AKT信号通路影响肝硬化-肝细胞癌癌前病变的研究进展[J].临床肝胆病杂志,2018,34(1):192-194.

[20]吴灿,黄亮,莫立乾,等.丹参多酚酸盐通过TGF-β1/Smad和PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制大鼠肝纤维化的进展[J].中国医院药学杂志,2019,39(7):670-675.