抗酸染色、Xpert MTB/RIF 与T-SPOT.TB 联合检测在结核病诊断中的应用价值

罗 倩 刘泽远 刘 陈 娟 童尧尧 任凌霜 伍仕敏

1长江航运总医院检验科 湖北 武汉 430014；2武汉大学公共卫生学院 湖北 武汉 430071；3武汉市金银潭医院检验科 湖北 武汉 430032；4武汉市临床检验中心 湖北 武汉 430030

结核病（tuberculosis，TB）作为一种以呼吸道传播为主的慢性传染病，严重威胁着人类健康，是当前全球重要的公共卫生问题之一［1］。据世界卫生组织（WHO）发布的《2020 年全球结核病报告》统计，2019 年全球估计新增结核病患者约1 000 万例，实际报告新确诊结核病例为710 万，约44%的新发病例分布在东南亚地区，中国占比约为8.4%，仅次于印度（26%）和印度尼西亚（8.5%），位列第3［2］。

临床统计数据显示，结核病的治疗成功率约为85%［3］，及时准确的诊断和治疗不仅有助于减少结核病死亡结局的发生，还可以进一步减少结核病的传播。因此，结核病的早期诊断对于结核病防治具有十分重要的意义。传统的结核病诊断“金标准”是结核菌培养，但是由于传统的固体培养检测时间较长，液体培养所需设备昂贵，且灵敏度相对较低［4］，无法满足临床对结核病诊断的需求。目前，临床常用的结核病实验室诊断技术主要包括抗酸染色、培养、巢式实时荧光PCR 法（Xpert MTB/RIF）和结核感染T 细胞斑点试验（tuberculosis infection T cell spot test，T-SPOT.TB）等方法，后两种诊断方法的使用可以大大缩短检测时间。

本研究通过回顾分析确诊结核病患者、临床诊断结核病患者和健康体检者抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB 实验室检测结果，从而研究抗酸染色、Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 单独或联合检测在结核病诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1研究对象 回顾分析2017 年1 月至2019 年12 月在武汉市金银潭医院检验科进行抗酸染色涂片、Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 检 查 的19 410例患者和45 例健康体检者的检查结果，结合病例资料进行研究。

1.1.2纳入排除标准 纳入标准：2017 年1 月至2019 年12 月在武汉市金银潭医院检验科接受结核病相关实验室检查的患者和健康体检者。结核病诊断依据《肺结核诊断标准（WS288-2017）》和中华医学会《临床诊疗指南—结核病分册》，以病原学检查为主，同时结合患者的流行病学史、临床表现、影像学检查、及其他辅助检查进行综合分析。

排除标准：①诊断不明或临床诊断为非肺结核病患者。②就诊时年龄小于18 周岁的患者。③人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体检测阳性患者。排除原因：由于婴幼儿和艾滋病患者的免疫系统功能不健全，导致这两类人群在接受T-SPOT.TB 检测时相较于一般结核病人群灵敏度较低。资料的收集遵循知情同意原则。

1.1.3分组情况 排除其中诊断不明确或临床诊断为非肺结核病患者8 014 例，排除就诊年龄小于18 岁患者974 例和HIV 抗体检测阳性患者499 例，最终纳入研究的人数为9 968 例。其中，有明确细菌学证据（结核培养阳性）的确诊结核病组患者1 299 例（包括肺内结核和肺外结核；男性患者969例，女性患者330 例），临床诊断肺结核组患者8 624例（男性患者5 872 例，女性患者2 752 例），健康对照组45 例（男性27 例，女性18 例）。

1.2 方法

1.2.1仪器与试剂 BHC-ⅡB2 二级生物安全柜（型号：苏州安泰空气技术有限公司），显微镜（型号：CX21，日本OLYMPUS 公司），抗酸染色液（珠海贝索生物科技有限公司），GeneXpert MTB/RIF 仪器及相应试剂盒（美国Cepheid 公司），T-SPOT.TB 检测试剂（英国Oxford Immuno-tec 公司）。

1.2.2检测方法

1.2.2.1抗酸染色 用接种环挑取痰液中干酪样坏死小块或带血小块，制成厚涂片，烘箱干燥15 min后取出染色架，放置于水槽上。趁玻片发烫时滴加石炭酸复红染液盖满痰膜，保持染色5 min（染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液）。然后，用流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。自痰膜上端外缘滴加3%盐酸乙醇盖满玻片，脱色1 min（如有必要，流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止）。用流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。滴加亚甲蓝复染液，染色30 s 后，用流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水。待玻片干燥后置油镜下观察：未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌，脱色经复染呈蓝色的细菌为非抗酸性细菌。

1.2.2.2Xpert MTB/RIF 采取膜过滤法提取核酸，通过超声破碎细胞，然后通过滤膜来分离蛋白和核酸。视不同样本情况先进行前处理，如痰样本过于黏稠，可先加入适量4% NaOH，震荡混匀后静置15～20 min，待样本充分液化后进行操作。组织样本需先加入少量生理盐水后研磨，至肉眼见样本为均匀悬液样，再进行操作取待测样本约0.5 mL 加入试剂盒提供样本处理液1.5 mL 中，来回振摇10～20 次，使其充分混匀后，静置15 min，取液化后样品（尽量不含颗粒和块状物）1 mL 加入反应盒指定孔上机检测（避免气泡）。试验结束后软件可自动判读结果，判断待测样本中是否检出结核分枝杆菌复合群，如果检出，同时判断是否检出Rif Resistance。当样本中含有结核分枝杆菌复合群时，5 个目的片段分别扩增，仪器的GeneXpert Dx 系统会测量荧光信号和计算每根探针的Ct 值，得到一个半定量的结果。当5 支探针均为阳性的时候，即为检出结核分枝杆菌复合群且对利福平敏感。如果这5 个目的片段有突变，就会有相应探针的扩增失败，单根探针的结果为阴性，则提示检出结核分枝杆菌复合群且对利福平耐药。系统软件同时设定探针中较低的Ct 值为模板起始浓度，如果某根探针扩增阳性，但Ct 值与起始浓度差大于系统设定范围，也会被判定为利福平耐药。当扩增产物浓度过低，系统计算值会处于灰区，出现耐药不明确的结果。

1.2.2.3T-SPOT.TB 检测 采集患者外周静脉血，在室温下进行运输和保存，全程严格按照试剂盒说明书进行操作。结果判定：如果抗原A 和/或抗原B 有应答，检测结果为“有反应性”时，参照以下标准：空白对照孔斑点数为0～5 个时且（抗原A 或抗原B 孔的斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6；空白对照孔斑点数为6～10 个时且（抗原A 或抗原B孔的斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）。如果不符合上述标准且阳性质控对照孔正常时，检测结果为“无反应性”。当阳性质控对照孔的结果为“不确定”且抗原A 和抗原B 孔的结果均为“无反应性”时，认为该实验结果为“并不确定”，需进行复查。

1.3 观察指标分别统计三种检查方法单独检测，抗酸染色与GeneXpert MTB/RIF 或T-SPOT. TB联合检测的结核阳性检出率，并比较其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等指标。

1.4 统计学处理使用Microsoft Excel 2019 建立数据库，采用SPSS 20.0 统计软件进行数据统计，计数资料用例数（例）表示，计量资料用均数±标准差（±s）描 述，计 数 资 料 运 用χ2检 验 进 行 比 较，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人群一般资料纳入的研究对象被分为确诊结核病组（包括肺内结核和肺外结核）、临床诊断肺结核组和健康对照组。确诊结核病组共1 299 例患者，其中男性969 例，女性330 例，平均年龄为（47.82±18.46）岁；临床诊断肺结核组共8 624 例患者，其中男性患者5 872 例，女性患者2 752 例，平均年龄为（47.08±17.77）岁；健康对照组共45 例，其中男性27 例，女性18 例，平均年龄为（38.01±13.54）岁。见表1。

表1 研究对象的一般资料

2.2 三种诊断方法单独检测结核病的阳性率的比较在确诊结核病组中，抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 检测的阳性检出率分别为62.4%（811/1 299）、86.7%（1 072/1 236）和98.0%（292/298），与抗酸染色相比，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 检测阳性率差异有统计学意义（χ2=195.7 和χ2=57.4，均P＜0.01）。临床诊断肺结核组患者抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB 的阳性检出率分别为16.2%（1 319/8 163）、59.7%（1 231/3 056）和74.8%（2 508/3 352），与 抗 酸 染 色 相 比，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 检测阳性率差异有统计学意义（χ2=736.7 和χ2=3 685.3，均为P＜0.01）。见表2。

表2 单项检查结核阳性检出率比较

2.3 抗酸染色和Xpert MTB/RIF 联合检测诊断效果比较在确诊结核病组和健康对照组中，分别有1 236 和45 例患者接受了抗酸染色和Xpert MTB/RIF 检测。如表3 所示，抗酸染色、Xpert MTB/RIF 检测和联合检测的灵敏度分别为63.2%、86.7%和89.6%。联合检测的灵敏度与抗酸染色或Xpert MTB/RIF 单独检测相比，差异有统计 学 意 义（χ2=816.2 和χ2=5.0，P＜0.01 和P=0.025）。抗酸染色和Xpert MTB/RIF 单项检测灵敏度差异有统计学意义（χ2=182.5，P＜0.01），特异度差异无统计学意义。抗酸染色和Xpert MTB/RIF 单项检测或联合检测特异度均为100%。单项检测或联合检测的阳性预测值差异无统计学意义，抗酸染色、Xpert MTB/RIF 检测和联合检测的阴性预测值分别为9.0%、21.5% 和26.0%，Xpert MTB/RIF 单独检测或联合检测的阴性预测值与抗酸染色相比差异有统计学意义（χ2=20.9 和χ2=32.1，均P＜0.01）；抗酸染色、Xpert MTB/RIF检测和联合检测的正确率分别为64.5%、87.2%和90.0%，Xpert MTB/RIF 单项检测或联合检测的正确率与抗酸染色相比差异有统计学意义（χ2=180.4和χ2=237.4，均P＜0.01）。

表3 抗酸染色和Xpert MTB/RIF 联合检测诊断效果比较[%(n/N)]

2.4 抗酸染色和T-SPOT. TB 联合检测诊断效果比较在确诊结核病组和健康对照组中，分别有298 和45 例患者接受了抗酸染色和T-SPOT.TB 检测。如表4 所示，抗酸染色、T-SPOT.TB 检测和联合检测的灵敏度分别为58.7%、98.0%和98.7%。抗酸染色、T-SPOT.TB 检测和联合检测的特异度分别为100%、84.4%和84.4%。联合检测的灵敏度、特异度与抗酸染色相比差异均有统计学意义（χ2=141.7 和χ2=5.6，P＜0.01 和P=0.018），与T-SPOT. TB 单独检测相比差异无统计学意义。T-SPOT.TB 单项检测的灵敏度、特异度与抗酸染色相比差异均有统计学意义（χ2=135.4 和χ2=5.6，P＜0.01 和P=0.018），与T-SPOT. TB 单独检测相比差异无统计学意义。单项检测或联合检测的阳性预测值差异无统计学意义，抗酸染色、T-SPOT. TB 和联合检测的阴性预测值分别为26.8%、86.4%和90.5%，T-SPOT. TB 单独检测或联合检测的阴性预测值与抗酸染色相比差异有统计学意义（χ2=52.0 和χ2=57.0，均P＜0.01）；抗酸染色、T-SPOT.TB 和联合检测的正确率分别为64.1%、96.2%和96.7%，T-SPOT. TB 单独检测或联合检测的正确率与抗酸染色相比差异有统计学意义（χ2=111.0 和χ2=116.3，均P＜0.01）。

表4 抗酸染色和T-SPOT.TB 联合检测诊断效能比较[%(n/N)]

2.5涂阴结核病患者 Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 检出效果比较在确诊结核病组中，有455 例涂阴结核病患者进行了Xpert MTB/RIF检测，结果327 例检测为阳性，128 例检测为阴性，阳性率为71.6%（327/455）；有123 例涂阴结核病患者进行了T-SPOT.TB 检测，结果为119 例检测结果为阳性，4 例检测结果为阴性，阳性率为96.7%。卡方检验表明，两种检测方法对于涂阴的结核病患者灵敏度差异有统计学意义（χ2=34.0，P＜0.01），T-SPOT.TB 检测灵敏度更高。

3 讨论

我国作为全球30 个结核病高负担国家之一，结核病防控形势依然十分严峻，每年报告新发结核病患者约80 万例，位居法定传染病第2 位［5］。为实现我国《遏制结核病行动计划（2019—2022 年）》中要求的到2022 年全国肺结核发病率降至55/10 万以下，死亡率控制到3/10 万以下的行动目标，必须加大筛查力度，最大限度发现患者。抗酸染色是临床最常用的一种结核病快速诊断方法，具有检测时间短、操作简单、价格低廉等优势，但是其检测灵敏度相对较低，通常情况下检出率仅为30%～50%，假阴性的情况较多。因此，对于结核病患者特别对于多次涂阴的结核病患者亟需一种更加快捷的联合检测方法以提高诊断的灵敏度。

Xpert MTB/RIF 是由美国Cepheid 公司开发的，并获得世界卫生组织推荐的结核病快速诊断技术，不仅具有较高的结核病诊断灵敏度和特异度［6］，同时还可以快速准确检测出利福平耐药基因（ropB突变基因），对临床结核病的诊断和治疗具有重要意义。除了一般成人肺结核病人外，Xpert MTB/RIF 检测对于肺外结核患者［7］、儿童肺结核患者、艾滋病患者等特殊结核病患者同样有着较好的检出效果。T-SPOT.TB 试验是基于γ 干扰素释放实验（TB-IGRA）原理，通过酶联免疫斑点技术特异性检测受试者体内结核效应T 细胞，从而达到诊断受试者是否感染结核杆菌的目的，具有早期、快速、价廉、生物安全性高和应用范围广等特点。现有研究表明，其在结核病的诊断中同样具有非常高的灵敏度和检出率，对于儿童结核病患者其灵敏度和特异度分别为84.0%和99.1%［8］，对于合并HIV 感染的结核病患者其检测灵敏度和特异度分别为83.7%和80.2%［9］。

本研究回顾分析了2017 年1 月至2019 年12 月在武汉市金银潭医院住院的19 410 例患者和45 例健康体检者的抗酸染色、Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 的检查结果，共有9 968 例患者纳入研究，分为确诊结核病组（包括肺内结核和肺外结核）、临床诊断肺结核组和健康对照组。结果表明，在确诊结核病组和临床诊断肺结核组中，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 检测的阳性检出率显著高于抗酸染色；另外，确诊结核病组抗酸染色、Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB 检测的阳性检出率同样显著高于临床诊断肺结核组和健康对照组。

进一步研究发现，Xpert MTB/RIF 检测结核病的灵敏度和特异度分别为86.7%和100%，对涂阴的结核病患者阳性检出率为71.6%，灵敏度略低于李秋平等［10］（92.1%）的报道，而对于涂阴的结核病患者阳性检出率则高于杨健等［11］（61.0%）的报道。T-SPOT.TB 检测结核病的灵敏度和特异度分别为98.0%和84.4%，对涂阴的结核病患者阳性检出率为96.7%，灵敏度略高于黎永华等［4］（91.8%）的报道，与李晓和乔美芳［12］的研究报道的灵敏度（97.56%）持平，而对于涂阴的结核病患者阳性检出率则高于Liu 等［13］（81.4%）的报道。

在分别使用三种方法单独进行结核病诊断时，相较于抗酸染色，Xpert MTB/RIF 和T-SPOT.TB均具有较高的灵敏度，但T-SPOT.TB 检测的特异度稍低。 在抗酸染色与Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 联合检测时，相较于单独使用抗酸染色可有效提高检测的灵敏度和检出率。但是，联合检测的检出效果相较于Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 单独检测提升并不明显，主要是由于Xpert MTB/RIF 和T-SPOT. TB 诊断方法自身具有较高的灵敏度，在与抗酸染色联合检测时提升空间有限。抗酸染色在临床检验科应用广泛，因此本研究结果显示，通过对抗酸涂片阴性的疑似结核病患者进行Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 联合检测，可以在较低的检测成本条件下获得较好的检出效果，对于经济欠发达和医疗资源相对缺乏地区的结核病筛查具有重要意义。需要进一步指出的是，虽然本研究显示，T-SPOT.TB 联合痰涂片对结核病的辅助诊断更加提高诊断的灵敏度，因此T-SPOT.TB 检测本身的阴性预测值较高，弥补了抗酸染色阳性预测值高而阴性预测值低的不足，二者联合检测更加能够提升诊断效能。

同时，本研究也存在一定的局限：由于是回顾性研究，加上资料来源于传染病医院，可纳入研究的健康对照组病例数相较于病例组较少，这些同期研究的健康人群多是本院职工的体检结果。但由于本研究涉及的研究对象较多、时间跨度较大，并且数据来源于回顾分析，因此得出的结论会更加客观、公正、科学，同时再一次证实前期本研究团队对IGRA 的前瞻性研究结论［14］。

综上所述，本研究结果表明：在结核病诊断中，抗酸染色作为常规检测项目灵敏度较低，Xpert MTB/RIF 或T-SPOT. TB 检测灵敏度明显高 于 抗 酸 染 色。 采 用 Xpert MTB/RIF 或T-SPOT.TB 联合抗酸染色均可显著提高结核病诊断的灵敏度，特别是对于涂阴结核病患者，联合T-SPOT.TB 检测可显著提高诊断效能。