Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及诊断价值

张 琳,陈 晨,于艺冰,宋 辉,郭媛媛,李峰敏

(秦皇岛市第一医院 血液科,河北 秦皇岛066000)

弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)为非霍奇金淋巴瘤中常见的组织学疾病，生长速度快，异质性与侵袭性强，其异质性主要表现在组织学类型、分子遗传、临床表现等方面[1]。目前DLBCL的发病机制尚不明确，且治疗后极易复发，病情进展快，故临床寻找发病机制十分重要[2]。Bcl-2为参与凋亡调控的因子，与淋巴瘤的发生相关[3]。研究显示[4]，miR-26a在肝癌、结直肠癌、膀胱癌等肿瘤中具有抑癌作用，在肺癌中具有促进肿瘤转移作用，miR-26a在DLBCL中表达低于B淋巴细胞。AXL(Anexelekto)最早发现于白血病，与肿瘤的侵袭转移相关，可预测生存率[5]。为此，在本文研究中分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在DLBCL中的表达，并分析三者与DLBCL的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年6月-2021年6月秦皇岛市第一医院血液科归档的资料完整的85例DLBCL患者作为研究组，另外选取85例淋巴结反应增生患者为对照组。研究组男42例，女43例，年龄16-72岁，平均(41.82±27.85)岁。对照组男40例，女45例，年龄15-73岁，平均(42.05±28.11)岁。本次研究所有DLBCL患者均知情同意，且签署了知情同意书。

纳入标准：研究组患者符合《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断与治疗指南》[6]中对于弥漫大B细胞淋巴瘤的诊治标准，患者病灶可进行测量，患者为首次发病。

排除标准：患者心肝肾功能不全，患者处于妊娠哺乳期，患者肿瘤侵犯中枢神经系统，患者有淋巴瘤病史，患者精神状态异常。

1.2 检测方法

1.2.1Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL检测 采用免疫组化法检测所有患者体内Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表达水平，采集患者淋巴组织，使用10%甲醛溶液进行固定，石蜡包埋，后添加二甲苯进行石蜡脱化，使用0.3%H2O2对组织内过氧化物酶进行降解，并使用PBS冲洗后进行封闭处理，加入稀释后一抗过夜，后倒去作用液，用PBS清洗5 min，加入二抗，放于37℃下30 min，进行清洗，加入甘油进行封皮，随机选取10个高倍视野显微镜下观察结果，阳性表现主要为细胞核与细胞质染为黄色与棕黄色，阴性未被染色，对阳性细胞所占比例与染色强度乘积评分，0分为显微镜下观察10个高倍视野阳性细胞所占比例≤5%，1分为6%-25%，2分为26%-50%，3分为≥51%，0分为无着色，1分为浅着色，2分为着棕黄色，3分为着棕褐色，阳性细胞所占比例与染色强度乘积0分为(-)，1-4分为(+)，5-8分为(++)，9-12为(+++)。

1.2.2Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表达水平检测

采用实时荧光定量法检测Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表达水平，提取样本RNA，使用高速离心机，将细胞原液放于15 ml离心管，离心处理后弃去上清，使用Takara逆转录试剂盒行逆转录处理获得总cDNA后使用Primer5.0设计进行引物序列，启动PCR仪，反应体系：20 μl，反应条件：95℃ 15 min，94℃变性30 s、60℃退火延伸34 s，共进行40个循环，采用2-△△Ct方法计算出Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表达量。Bcl-2上游引物序列：5’-CAGCCTTGAAACATTGATGG-3’，下游引物序列：5’-TATGGTGGTTTGACCTTTAG-3’；miR-26a-5p上游引物序列：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCAAGTAATCCAGGA-3’，下游引物序列：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’；p-AXL上游引物序列：5’-ACGCATGAGCCGAAGCTAAC-3’，下游引物序列：5’-AGGGACCCTTAGGCCATTGT-3’；内参U6引物序列：上游：5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’，下游：5’-GCATTTGGTGGTATTGGG-3’。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Bcl-2、miR-2 6a-5p、p-AXL在DLBCL中的表达

如表1所示，与对照组相比，研究组中Bcl-2、p-AXL表达量升高，miR-26a-5p表达量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在DLBCL中的表达

图1 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL在对照组、研究组中的表达免疫组化图(×200)

2.2 研究组患者Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表达水平与病理参数的关系

如表2所示，Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表达水平与DLBCL患者性别、年龄、B症状无关，与患者原发部位、免疫表型、Ann-Arbor临床分期、乳酸脱氢酶、IPI评分、结节累及、Ki-67指数有关，非生发中心来源、Ann-Arbor分期为Ⅲ-Ⅳ期、乳酸脱氢酶>245 U/L、IPI评分3-5分、结节累及≥2处、Ki-67指数≥75%，DLBCL患者Bcl-2、p-AXL表达水平升高miR-26a-5p表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 研究组患者Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL表达水平与病理参数的关系

2.3 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL之间相关性分析

如图2所示，Bcl-2、miR-26a-5p呈负相关(r=-0.532，P=0.001)；Bcl-2、p-AXL呈正相关(r=0.607，P=0.001)；miR-26a-5p、p-AXL呈负相关(r=-0.533，P=0.001)。

图2 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL之间相关性分析

2.4 ROC曲线分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL对DLBCL的诊断价值

如表3、图3所示，ROC曲线显示，与Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL单项诊断相比，三项联合对DLBCL的诊断价值较高(P<0.05)。

表3 ROC曲线分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL对DLBCL的诊断价值

图3 Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL诊断DLBCL的ROC曲线

3 讨论

临床研究显示，淋巴瘤发病时淋巴结可快速增大，且伴有淋巴结外病与骨髓侵犯。肿瘤的发生与发展涉及多种因素，基因的异常表达在肿瘤的发生与发展有重要作用[7-8]。

原癌基因Bcl-2存在于细胞中线粒体核膜、外膜孔粗面内质网上，是一种膜蛋白，可使细胞的凋亡受到抑制，并调节B细胞的发育与分化[9-10]。研究表明[11-12]，45%DLBCL患者体内Bcl-2处于高表达，Bcl-2基因与免疫球蛋白融合，可导致患者预后不佳。Bcl-2过度表达会抑制细胞株凋亡，且可调控组织细胞凋亡，使组织中细胞凋亡与增殖失衡，导致对化疗不敏感[13]。本文研究显示，Bcl-2在DLBCL患者体内表达升高，且其表达随着Ann-Arbor分期而升高，其原因可能为Bcl-2基因改变肿瘤细胞生物学行为，使患者表现出不同症状。

miR-26a-5p在多种肿瘤中具有抑癌作用，在结直肠癌低表达，为诊断结直肠癌的新型生物标志物[14]。有研究表明[15]，miR-26a-5p表达下调可经诱导上皮间质转化，使肝癌转移，并使患者的预后受到影响，miR-26a-5p在膀胱癌组织中低表达，上调其miR-26a-5p可抑制其癌细胞的迁移与侵袭，且miR-26a-5p在前列腺中表达降低，前列腺细胞的迁移、侵袭受到其影响。miR-26a-5p可通过不同的靶基因调控不同的信号通路，发挥其对癌细胞的抑制或促进作用[16]。从表1可以看出，miR-26a-5p在患者DLBCL患者体内表达降低，且与患者的Ann-Arbor分期负相关，因此可作为为DLBCL发展的标志。

AXL蛋白属于受体酪氨酸激酶家族中的一员，与其他抗体结合为肺癌、乳腺癌等疾病的预后不良标志物，AXL参与肉瘤的发生与发展，并可促进骨肉瘤细胞的侵袭与转移[17]。AXL可通过激活AKT信号通路介导肿瘤细胞的耐药性，AXL在食管癌细胞中高表达可使患者产生耐药性。研究表明[18]，肿瘤细胞可通过释放活性氧促进Gas6分泌，与AXL结合，促进肿瘤的发生发展。本文研究发现，p-AXL高表达与DLBCL患者，且与患者的免疫表型、Ann-Arbor分期等病理参数相关。另外本文采用相关性分析Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL与DLBCL之间的关系，提示Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL可能共同参与此病的发生进展，但本文并未深入分析其具体作用机制，因此本文结果还需后续研究进一步分析，以明确Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL参与DLBCL的作用机制，为临床上此病的诊治提供参考。

综上所述，Bcl-2、p-AXL在DLBCL患者表达中升高，miR-26a-5p在患者中表达降低，推测Bcl-2、miR-26a-5p、p-AXL可能共同参与此病的发生发展。