基于免疫途径的视神经炎模型的建立及其发病机制的探讨

郭洪亮，沈笑然

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院，北京100010；2.首都医科大学附属北京安贞医院，北京100020)

视神经炎是一种自身免疫性脱髓鞘疾病，在短时间内反复出现，导致视力下降甚至失明。该病病情进展迅速，多数患者为单相病程，少数病人可有缓解-复发，病程可长达10余年，有致残率高、易复发、预后差等特点，严重威胁人类的健康。本研究通过构建视神经炎的动物模型，并在此基础上进行视神经炎致病机制和可干预性治疗靶点的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

外源性IL-17单克隆抗体(美国thermo)。EP-1000 Pro型眼电生理检查仪(德国多美视觉电生理系统)。6-8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠(体重 18-22 g)20只，由首都医科大学动物实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1补体的提取 正常志愿者的血清中人体补体(hc)的制备：获取3名正常人血液后(经本院伦理委员会批准，与本人签署知情同意)，在室温下保存30 min后让血液凝结成血块，然后将此标本置于离心管中1 000 r/min 离心10 min，取上清液，即得到补体混合液，并贮存于-80℃中备用。

1.2.2间接免疫荧光法与直接免疫荧光法检测AQP4-Ab 间接免疫荧光法的 AQP4-Ab 检测方法：应用 Lennon 等[1]的方法进行 AQP4-Ab的检测；直接免疫荧光法检测AQP4-Ab 抗体:参照 Matsuoka等[2]的方法检测血清中 AQP4-Ab。二者均阳性病人的血清方可为本实验备用。

1.2.3视神经炎动物模型的制备 随机分为模型组和对照组各10只实验小鼠。对照组采用PBS 液行侧脑室注射，视神经炎组采用人体补体(hc)及水通道蛋白4抗体(AQP-4-Ab)侧脑室注射[3](该实验经本院动物福利与伦理委员会批准)。采用10份视神经脊髓炎患者(经本院伦理委员会批准，患者并监护人知情同意)血清经直接和间接免疫荧光法检测存在AQP-4 Ab阳性(见图1A-H)，每份取5 ml，置于促凝管内，当天待血液凝固后 2000-3000 r/min离心10 min后分离上层血清，上述血清被PBS稀释后，装载到蛋白A亲和层析柱上，然后冲洗、洗脱、中和，收集阳性部分，并进行透析、浓缩，再解离并保存在4℃冰箱中待用，其抗体部分含量为7.6-16.6 mg/ml。侧脑室注射体积是5 μl(其中3 μl抗体：2 μl补体)，免疫后第1、3、5、7天给予1次IL-17 0.1 mg腹腔内注射强化免疫，连续4次；对照组应用PBS液5 μl，无腹腔内药物强化。

图1 直接间接免疫法检测AQP4抗体阳性血清

1.2.4视神经闪光-视觉诱发电位(F-VEP)检查 参考FOX等的方法进行改良[4]，使用EP-1000 Pro型眼电生理检查仪，将小鼠置于室温恒定的20℃，无光、无声的暗室中30 min，麻醉后，并将小鼠置木板上固定。采用全视野持续闪光，刺激强度2cd/m2/s，刺激频率2.0 Hz，持续照射5 min。以电极钢针刺入皮下，记录电极、参考电极、接地电极分别置于小鼠枕部取两耳连线中点、小鼠额部、鼠尾等处。检测一眼时，将另一只眼完全遮盖。振幅、潜伏期分别以微伏(μV)、毫秒(ms)为单位，观察并记录波形。

1.3 视神经炎的症状评估采用以下标准

视神经炎评定：出现眼睑红肿或流泪记1分；出现单眼、双眼部分眼球萎缩或者部分失明记2分；出现单眼、双眼完全眼球萎缩或者失明记3分。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 行为学评价

对照组(10只)小鼠体重至免疫后两周平均增长(4.2±1.9) g。模型组小鼠(10只)发病，表现为体重下降,至发病时体重平均下降(7.9±2.6) g，发病后模型小鼠表现为活动少，进食少，皮毛不光滑。

2.2 视神经炎评定

10只模型鼠出现眼睑红肿和流泪5只；出现视力障碍3只，单眼或双眼盲2只。从视神经炎的评分分析看模型鼠35 d、45 d 与25 d比较，分值明显升高，差异明显，具有统计学意义，见表1。

表1 模型鼠不同时间视神经功能缺损评分

其中A：可见大鼠脑组织中可见室管膜周边有荧光免疫物沉积；图B：可见血管周围见荧光免疫标记物质沉积。图C：光镜下培养的HEK-293细胞形态：该细胞为转染并稳定表达的AQP-4的人体胚胎肾细胞-293；图D ：在波长为488 nm蓝色激发光下，可见在细胞膜发出绿色荧光，说明该病人血清中含有与抗原结合的AQP-4抗体，AQP-4抗体为阳性NMO病人，证明AQP-4在细胞膜上表达；E：在波长为405 nm的紫色激发光下，PI与细胞核结合，呈现蓝色荧光；F：是D和E的融合图；G：阴性对照组中的光镜下培养的并稳定表达的AQP-4的HEK-293细胞形态：H：在波长为488 nm蓝色激发光下，未见细胞膜发出的绿色荧光，说明该病人血清中未含有与抗原结合的AQP-4抗体。

2.3 视神经闪光-视觉诱发电位(F-VEP)检查的结果

2.3.1模型鼠与对照组(右眼)小鼠35天F-VEP检测 对照组(右眼)小鼠第35天进行F-VEP动态检测，结果呈现较为典型的ST表现(见图2 K)，S1：(36.17±3.24) ms，T：(58.06±3.03)ms;模型组小鼠于侧脑室注射免疫剂后第35天结果见图2 L，S1：(46.07±4.71) ms，T：(69.44±7.70) ms。模型组与对照组比较S1和T波潜伏期明显延长，两组数据比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图3,表2。

图2 第35天模型小鼠与对照组小鼠右眼F-VEP比较

表2 正常对照组与实验模型组第35、第46天(右眼)的相关数据比较

2.3.2模型鼠与对照组(右眼)小鼠46天F-VEP检测 对照组(右眼)小鼠第46天进行F-VEP动态检测，结果见图4 M，S1：(35.31±3.14) ms，T：(58.16±3.24) ms;模型组(右眼)小鼠于侧脑室注射免疫剂后第46天结果见图4 N，S1：(48.10±6.25) ms，T：(73.18±8.44) ms。模型组与对照组右眼在S1和T波潜伏期明显延长，两组数据比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图5,表2。

图3 第35天模型小鼠与对照组小鼠右眼F-VEP比较柱状图

图4 第46天模型小鼠与对照组小鼠右眼F-VEP比较

图5 第46天模型小鼠与对照组小鼠右眼F-VEP比较柱状图

2.3.3模型组小鼠与对照组(左眼)小鼠35天F-VEP检测 对照组(左眼)小鼠第35天进行F-VEP动态检测，结果见图6P，S1：(37.12±3.46) ms，T：(58.68±1.80) ms;模型组(左眼)小鼠于侧脑室注射免疫剂后第35天结果见图6Q，S1：(47.17±3.74) ms，T：(70.09±7.25) ms。模型组与对照组在S1和T波潜伏期明显延长，两组数据比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图7，表3。

图6 第35天模型小鼠与对照组小鼠左眼F-VEP比较

图7 第35天模型小鼠与对照组小鼠左眼F-VEP比较柱状图

表3 正常对照组与实验模型组第35、第46天(左眼)的相关数据比较

2.3.4模型鼠与对照组小鼠46天F-VEP检测 对照组(左眼)小鼠第46天进行F-VEP动态检测结果见图8 R，S1：(39.37±3.88) ms，T：(58.68±1.80) ms；模型组(左眼)小鼠于侧脑室注射免疫剂后第46天结果见图8S，S1：(47.16±2.92) ms，T：(71.26±8.25) ms。模型组与对照组在S1和T波潜伏期明显延长，两组数据比较差异有统计学意义(P<0.05),见图9，表3。

图8 第46天模型小鼠与对照组小鼠左眼F-VEP比较

图9 第46天模型小鼠与对照组小鼠左眼F-VEP比较柱状图

3 讨论

本研究是在神经系统免疫性疾病的视神经脊髓炎(NMO)动物模型基础上建立的视神经炎小鼠模型，既往研究视神经脊髓炎的动物模型是在实验性自发性脑脊髓炎模型(EAE)基础上建立的[3-4]，而EAE模型大多数神经炎症状缺如，如髓鞘胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的 C57BL/6模型，也主要发生于脊髓部位[5]，但是这些动物模型的病理特征主要模拟了多发性硬化的病变特性，视神经炎症状不易诱发，较难接近NMO的病理特征。有研究者[6-7]采用双重的转基因鼠做的EAE模型非常接近人类的NMO。

通过转基因处理后的TCRMOG鼠和IgHMOG鼠进行杂交,这种鼠带有MOG抗原表位特异受体，它们30%的B细胞结合于MOG抗原表位，同时分泌自身抗体。约一半的杂交TCR MOG X IgH MOG鼠自发的发展为严重的实验性自身免疫性视神经脊髓炎，但制备该模型鼠要求实验条件较高，周期较长，成功几率较小，不利于短期、大量的基础实验研究。国外有研究[8-9]把IgG-AQP4 和人血清补体一同注射到大鼠脑实质内可产生接近NMO的动物模型，但按其文献记载方法制备动物模型时，根据实验结果显示：采用脑实质注射后小鼠死亡较多，在注射后可出现局灶性的视神经脊髓炎样病灶。还有研究显示[10]：应用MOG35-55与AQP-4抗体共同免疫小鼠时，其模型出现视神经症状较少，其机制仍在探讨中。

基于AQP-4Ab在NMO疾病上的关键作用[11-12]，以及补体-抗体依赖的细胞毒作用在NMO发病机制的研究[13]，本研究改良Samira Saadoun[9]的方法采用侧脑室注射技术，将经直接和间接免疫荧光法鉴定为AQP-4 Ab阳性的视神经脊髓炎病人收集血清提取水通道蛋白抗体，同时与人体补体混合后共同免疫C57BL/6小鼠，应用IL-17以强化小鼠体内的免疫反应，来获得自身免疫性视神经炎鼠模型，在获得AQP-4 Ab时，为了避免单一检测方法存在假阳性的可能，本研究使用的所有病人血清需要满足直接和间接免疫双荧光法鉴定为阳性，可用于抗体的提取，这是本研究的关键技术之一。当获得症状稳定的模型小鼠后，本研究通过视神经评分以及电生理学方面对脊髓炎和视神经炎症方面分别进行了鉴定。

研究显示模型组小鼠与对照组比较进食明显减少，体重下降，毛发脱失，精神萎靡。本研究观察发现模型鼠在临床表现上十分接近视神经炎病人，视神经评分上看在35天后症状逐渐达到高峰，表现为眼球萎缩，或视力下降，不能找寻食物与水源，眼部红肿流泪，甚至眼球萎陷，失明，与人类病症十分接近。

在视觉诱发电位的检测中，本研究采用F-VEP检测方法显示：模型组与对照组在S1和T波潜伏期明显延长，具有明显差异，说明脱髓鞘存在。在NMO的视神经损伤方面的临床诊断中，VEP在视神经脱髓鞘病变的检测中灵敏度较高，能发现亚临床病变，具有很高的应用价值[14]。但VEP 检测容易受许多因素的影响，比如刺激参数、麻醉深度、电极放置位置、环境和温度，同时也可能由于实验器材的敏感性等。本研究进而采用相同的实验条件进行检测，以对照组大鼠 F-VEP 测量值作为正常参考值，并对每只大鼠每只眼睛的F-VEP 进行对比观察，分别以第35天、46天的实验鼠与35、46天的对照鼠进行对比，结果对照组 T 波和S1 波潜伏期的数据变异小，数据稳定可靠，可作为进一步研究的参考依据。实验中10只发病大鼠病程中均出现主波潜伏期的延长和波形改变。一般认为VEP潜伏期的延迟主要由脱髓鞘病灶引起。故VEP的变化可以很好地反映视神经病变。但本研究检测的F-VEP特异度为不高，可能与样本量不够大有关。实验鼠在第35天时S1、T值逐渐达到高峰，后逐渐恢复，可能与髓鞘再生和修复有关。

综上，目前经行为学和神经电生理等方面诸多方法已验证视神经炎模型已建立成功，填补了国内在视神经炎动物模型方面的空白。