PLAG1与家畜脊椎数目体格形态相关性研究

文│刘紫雯 史晓渊 王天琦 王长法*（聊城大学农学与农业工程学院）

哺乳动物的骨骼主要由中轴骨、附肢骨和带骨3个部分组成，其中中轴骨又包括头骨、脊柱、胸骨和肋骨。不同的骨骼形态大小功能各不相同，并且在胚胎发育早期，骨骼的形态、数目及功能属性就已被确定，若此过程被扰乱则会导致骨骼发育障碍，造成先天性或后天性骨骼疾病。马属动物多形性腺瘤1（Pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1）基因是一个锌指蛋白编码基因，含有3个外显子，其所在的PLAG基因家族还有两个成员：PLAGL1和PLAGL2，比对PLAG1、PLAGL1和PLAGL2三者所编码产物的氨基酸序列，发现具有广泛的相似性，但具有不同的表达时期、范围、峰值等。在过去的研究中发现，PLAG1与各种肿瘤和青光眼的发病有关，但在最新的研究中发现，此基因还与脊椎动物椎骨数量及体格形态有明显的联系。笔者阐述了PLAG1的研究进展，以期为PLAG1在马属动物分子育种研究中奠定基础。

一、PLAG家族

1997年，Cas等在研究多形性腺瘤时发现，在8q12处均有相同的断裂点，经荧光原位杂交等方法对其进行深入分析，发现受染色体畸变影响的靶基因是PLAG1基因，它可编码一种新的锌指蛋白。目前研究结果认为，t（3；8）染色体异位使位于3号染色体的β辅肌动蛋白基因的启动子序列和位于8号染色体的PLAG1基因序列发生互换可能是导致PLAG1基因激活表达的主要原因。1998年Cas团队在此基础上进行了更加深入的研究，再次证明了PLAG1是一种由于8q12染色体畸变，因为启动子序列的替换而被激活的蛋白质编码基因。通过分离、鉴定、比较两个新的编码C2H2锌指蛋白的DNA序列，发现了PLAG基因家族的另外两个成员：PLAGL1和PLAGL2。并且这两个新发现的PLAG家族成员编码的蛋白质，其一级结构在氨基酸末端锌指区，特别是在PLAG1和PLAGL2的最后30个氨基酸之间，显示出很高的序列一致性。后来发现，PLAG家族的3个成员之间，N端的DNA结合域具有高度同源性，PLAG1和PLAGL1之间的同源性为73%，PLAG1和PLAGL2之间为79%，但C端的反式激活功能域同源性很低，PLAG1的C端与PLAGL1的同源性仅为19%，与PLAGL2的同源性为35%。PLAGL1位于染色体6q24-25上的一个印迹区，与PLAG1的多向致癌潜能不同，它是一种抑癌基因。与PLAGL1相比，PLAGL2不仅在结构上，在功能上与PLAG1也有更密切的联系。PLAGL1的羧基末端在上皮细胞和间充质细胞中表现出较强的转录活性，但PLAG1和PLAGL2在间充质细胞中只有在抑制区耗尽后才能激活。Declercq等研究PLAG基因家族如何影响细胞增殖和凋亡时发现，生长因子2（IGF-2）基因在唾液腺瘤中的表达高度上调，并且在IGF-2的启动子3中发现了潜在的PLAG1结合位点，提示PLAG1与细胞增殖相关生命活动有一定的关系。Zheng等通过体内蛋白质翻译后修饰实验证实PLAG1编码的244、263和353位氨基酸是蛋白质翻译后修饰的靶点，进一步研究证实蛋白质翻译后的修饰能抑制IGF-2的表达。PLAG1和PLAGL2接受乙酰化的调节，可被p300乙酰化和激活，可被NDAC7去乙酰化和抑制。小泛素相关修饰物（small ubiquitin—related modifier，SUMO）效应是一条三步骤酶信号通路，代表靶基因的转录活性，Yang等证实，SUMO效应在PLAG1和PLAGL2转活中发挥相反作用。SUMO效应的测定证实了PLAG1的244、263和353位氨基酸和PLAGL2的250、269和356位氨基酸为SUMO效应位点，且SUMO效应抑制PLAG1诱导的IGF-2表达。Alam等分析了PLAG基因家族在小鼠神经系统中的表达，发现这3个基因都在大脑皮层决定神经元命运的时候进行表达，提示PLAG基因家族可以影响大脑皮层祖细胞做出细胞命运选择。Cas等还发现，小鼠ZAC-1和人类PLAGL1之间的同源部分不包括ZAC-1中存在的34个PLE、PMQ和PML重复序列，也不包括这两种蛋白质的羧基末端，提出ZAC1可能是PLAG蛋白质家族的第四成员。

二、PLAG1的结构、功能和分布

人类PLAG1基因位于8号染色体长臂q12处，cDNA全长7317nt，包含5个外显子，编码框长度为1503bp，其表达产物PLAG1锌指蛋白由501个氨基酸构成。虽然PLAG1基因有5个外显子，但这5个外显子并不都能参与编码翻译，PLAG1基因的前3个外显子因缺少编码相应的启动子序列而不能参与翻译，第4个外显子包含编码起始密AUG，第5个外显子中有编码终止密码UAA，因此PLAG1是从第4外显子的最后端和第5外显子的起始端开始编码翻译。猪的PLAG1基因位于4号染色体上，包含4个外显子，全长50134nt，mRNA转录体有3个亚型，但只编码两种蛋白质，X1和X2亚型mRNA编码Ⅰ型蛋白质，由499个氨基酸构成，CDS序列均长为1500nt；X3型mRNA编码Ⅱ型蛋白质，由417个氨基酸构成。牛的PLAG1基因位于14号染色体，含有4个外显子，全长51953nt，含有3种转录本亚型，X1型转录本编码499个氨基酸残基组成的蛋白质，X2和X3型转录本编码完全相同的417个氨基酸组成的蛋白质。马的PLAG1基因定位在9号染色体上，包含5个外显子，全长53146nt，mRNA转录体也有3种亚型，编码蛋白质情况与猪相同，都编码由499和417个氨基酸组成的蛋白质。羊的PLAG1基因位于9号染色体上，全长12750nt，包含3个外显子；驴的PLAG1基因定位于12号染色体（本课题组组装版本，尚未公布），已知包含3个外显子，2个内含子，全长6801nt（86316851-86323651），与猪和马不同，驴的mRNA转录体只有两种，X1型包含3个外显子，2个内含子；X2型包含2个外显子，1个内含子。X1型编码蛋白含有499个氨基酸，X2型编码蛋白含有417个氨基酸。图1为多物种PLAG1基因的进化树分析及序列比对结果，可见在多个物种中序列相似性较高，说明PLAG1基因具有较高的保守性。如图2所示，在多个物种中，PLAG1基因与CNCND7和MOS基因连锁性较强，总是同时出现。

◎图1 多物种PLAG1基因的序列比对结果

PLAG1是在染色体8q12异常（通过启动子交换或启动子替换）而被激活的一种锌指蛋白编码基因。在许多人类肿瘤疾病中，PLAG1的激活是一个重要事件。微阵列分析表明，PLAG1的致癌能力可能是由IGF-2的有丝分裂信号通路介导的。PLAG1编码产物以一种特定方式结合DNA，这种结合主要利用锌指蛋白7根锌指中的3根，锌指6和7与核心相互作用，锌指3与G-簇相互作用。PLAG1、PLAGL1和PLAGL2的羧基末端结构域的亚区在哺乳动物细胞中与特定的DNA结构域连接时显示出不同的转录激活能力，从而证明这些蛋白质可以作为转录的正调控因子发挥作用。分析表明，PLAG1（Asp-385-Gln-500）和PLAG-2（Pro-382-Gln-496）中羧基末端的第二部分含有必需的转录激活域。Braem等利用酵母双杂交系统，鉴定出核外激素α2与PLAG1相互作用。体外谷胱甘肽S-转移酶下拉试验证实了PLAG1与核外激素α2之间的物理相互作用。核外激素α2通过与由短链碱性氨基酸组成的核定位序列（NLS）相互作用，将蛋白质护送到细胞核中。PLAG1的输入受其锌指结构域和核苷α2识别位点NLS1的控制。Alam等重点分析了PLAG基因在小鼠神经系统发育中的作用，发现PLAG基因在中枢和外周神经系统中以单独和部分重叠相结合的表达模式进行，虽然PLAG基因家族的3个成员在某些谱系中共同表达，但它们在其他组织中也表现出独特的、在时空上互补的表达模式。许多研究表明，PLAG家族编码蛋白是核蛋白的转录调节因子，调控体内许多重要基因的表达。PLAG基因在祖细胞群和有丝分裂后的神经元中都有表达，这表明它们在神经发育、控制细胞命运或增殖决定中既发挥早期作用，还可能参与后期分化过程。图3为多个数据库中PLAG1的功能性结构区域展示图。

◎图2 PLAG1及其邻近基因示意图

三、PLAG1在生物发育过程中的作用

脊椎的发生发育是一个极其复杂的过程，涉及多个信号传导通路及基因家族，如Hox基因家族及其信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路、FGF信号通路及RA信号通路等，这些信号通路及基因通过协同合作对动物椎骨的形成进行周期性调控，以确保其正常的形成及分化。自1997年发现PLAG家族成员以来，人们已经逐步认识到了PLAG家族的结构和功能，大量数据表明，此基因家族在调控脊椎动物椎骨数量方面发挥重要作用，但它们的信号途径、在复杂过程中的潜在作用等方面还有待研究。

研究发现，牛14号染色体上的PLAG1基因与牛的身高有关。PLAG1在垂体中大量表达，虽然下丘脑也含有表达PLAG1的细胞，但PLAG1的基因敲除并没有使下丘脑合成产物的表达水平发生显著改变，因此Juma等认为，PLAG1缺乏会降低小鼠生殖能力，但对雄性小鼠下丘脑-垂体系统的生殖控制并没有发挥主要影响。除了调控转录、控制代谢外，染色质包装可能是锌指蛋白发挥其调控作用的重要途径。PLAG1和NCAPGLCORL，两者都被称为成人身高基因座，在牛、马、狗和猪的体重/身高选择性扫描中都被检测到，研究表明，这些基因座对哺乳动物的生长过程和体型大小有显著影响。牛的进化以体型变化最为明显，Utsunomiya等对自新石器时代以来的牛体尺数据进行分析，发现PLAG1基因在牛体尺变化中起重要作用。遗传多态性对牛的性状改良具有重要影响，家族的多态性将极大地改变牛的生长性状，徐伟等对566头牛混合DNA样本进行测序以检验PLAG1多态性与生长性状之间的关系，在PLAG1基因内部检测到一个19bp的Indel突变，PCR结果显示3个基因型和2个等位基因：142bp（W）和123bp（D），其中WW基因型和W等位基因型在研究群体中占优势。赵拴平等以安徽大别山牛为试验群体，采用PCR和直接测序技术检测PLAG1基因的多态性，在PLAG1基因第1内含子区检测到了上述徐伟等检测到的19-bp Indel位点，3’UTR区检测到1个变异位点g.48316C＞T，二者均属于中度多态（0.25＜PIC＜0.50），其中19-bp Indel位点偏离Hardy-Weinberg平衡状态，推测这个19bp的Indel位点可能是普遍存在于各牛品种中。除了上述19-bp Indel位点，吴慧等选取5个品种的744只绵羊，DNA混池测序后发现PLAG1基因中存在两个Indel位点（均位于内含子1中），对这两个Indel位点进行相关分析，结果显示具有较高的遗传多态性，并且与成年羊的体重及体格大小显著相关（P＜0.05）；徐洪伟等选取了来自7个绵羊品种的2350只绵羊，全基因组分析显示，在CHCHD7基因下游2758bp的位置有一个8bp的缺失，将此indel位点与上述吴慧等的研究结果进行连锁不平衡分析发现，这两个基因的缺失变异虽然不存在强连锁，但是与滩羊的生长性状存在显著相关性（P＜0.05）。An等对463头日本和牛的体尺性状进行了全基因组关联分析，分别检测到18个、5个和1个与尻高、体高和体长性状相关的SNP，其中与尻高有关的SNP位点就定位于PLAG1基因内。另有研究表明，中国牛品种如秦川牛、品安牛、咸安牛和嘉县红牛的部分位点具有多态性，相关分析表明，该多态性与这些牛品种的身高有关。Zhang等在研究中国桐城大白猪NR6A1、PLAG1和VRTN基因多态性与椎骨数量的关系时，应用全基因组关联分析发现，NR6A1、PLAG1和VRTN与猪的椎骨数量显著相关（P＜0.05）。

◎图3 驴PLAG1基因功能性结构展示图

四、PLAG1的突变及其生物学功能

研究发现，超过一半的肿瘤显示出反复的染色体异常，其中8号染色体的重排最为频繁（超过50%），通常涉及8q12带，最常见的畸变是t（3；8）（p21；q12），3p21为优先异位伙伴。β-连环蛋白是黏附连接和WG/WNT信号通路中作用的一种界面蛋白，t（3；8）（p21；q12）导致PLAG1和β-连环蛋白（CTNNB1）组成性表达基因之间的启动子交换。Voz等为了评估异位伙伴对PLAG的重要性，他们将另一个异位：t（5；8）（p13；q12）融合在两个基因的5’非编码区，在保留编码序列的同时交换调控元件，该异位突变导致了白血病抑制因子受体的广泛表达。Li等在研究PLAG1基因在不同组织不同发育时期的表达时发现，其在所有组织中均有表达，但在5月龄和36月龄的成年牛中表达量差异极显著（P＜0.01），且存在两种变异体，相关性分析表明，这两个变异体与生长性状相关联。Song等采用全基因组关联分析来鉴定与胴体性状相关的遗传变异，利用压缩混合线性模型对1141头中国西门塔尔牛的770K基因型单核苷酸多态性数据进行了全基因组关联分析，共发现17个显著相关的SNP位点，在PLAG1-CHCHD7基因区内发现一个多效的数量性状核苷酸（QTN），命名为BovineHD1400007259（p＜10-8），它控制着关节、二头肌和小腿性状的变异。

据笔者所知，PLAG1基因在马属动物身上至今还没有深入的研究。本课题组进行驴的屠宰试验发现，德州驴的胸椎（thoracic vertebra）数一般为17～19根，腰椎(Lumbar vertebra)数一般为5～6根，并且胸腰椎数的组合主要存在5种类型：L5T17（2.8%）、L5T18（76.5%）、L5T19（0.9%）、L6T17（10.4%）、L6T18（9.5%），其中L5T18占比最高。本课题组研究发现，德州驴多一根胸椎体长增加4.3厘米，多一根腰椎体长增加2.4厘米，多一根椎骨净肉重增加7.2千克，皮重增加0.65千克，由此可见选育多胸腰椎数的亲代驴对驴产业具有较大的经济效益。胸腰椎数目变异与驴的经济效益相关，因此在驴的分子育种领域对与胸腰椎数有关的分子标记进行更加深入的研究意义重大，基于PLAG1在其他动物身上已经获得的研究结果我们推测，此基因可作为研究驴胸腰椎数有关的候选基因。

综上所述，PLAG1基因不仅与各种肿瘤、癌症、青光眼有关，还与多种动物的椎骨数量、骨密度、体高、体长等生长性状密切相关，虽然单独PLAG1基因内部的突变并不能直接带来动物表型的改变，但研究其突变对于探索基因如何调控动物的生长性状具有不可忽视的作用，它与不同基因的协同作用也许就是未来分子育种的一大助力。