闽北乌龙茶寡肽的活性研究

刘慧，王小娟，王弛，谢勇，赵峰*

（1. 福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2. 闽江师范高等专科学校，福建 福州 350109；3. 福建省中药资源重点实验室，福建 福州 350122）

茶叶历史悠久，可追溯至三千年以前，我国诸多本草典籍［1，2］中均可见关于“茶可治病”的记载。目前，众多学者对于茶叶的研究多聚焦于茶叶的功效成分及其作用机理，尤其是茶多酚、氨基酸、茶多糖等功效成分［3，4］，诸如茶叶寡肽活性研究报道尚处于起步阶段。寡肽，是一种由2～10个氨基酸分子通过酰胺键连接而成的小分子量蛋白质［5］，近年来相关报道显示其具有独特的呈味作用和生物活性，茶叶中寡肽的活性表达值得进一步探究。乌龙茶是中国六大茶类之一，茶性适中，传统上认为其可“润肤益肺、生津润喉、清除余热”［6］。现代药理学证实，乌龙茶富含茶多酚、茶氨基酸等多种生物学活性成分，具有降血脂、抗突变、抑制肥胖、抗癌等［7－12］作用。相较于茶氨基酸，寡肽吸收速率快［13］，且具有降血糖、降血脂、抗氧化、免疫调节、抗过敏等［14－22］活性。因此，本研究以闽北乌龙茶为原料制得寡肽粗提物，进一步采用膜分离方式制得500～1500 Da分子量段寡肽，并初步探究了其相关生物学活性的表达，以期为活性寡肽序列筛选和茶叶活性表达机制研究指明方向。

1 材料与方法

1.1 试验材料

闽北乌龙茶，购自耀东方茶叶有限公司，产地为武夷山。

1.2 试剂与仪器设备

主要试剂：正戊烷，丙酮，二氯甲烷，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯，α-葡萄糖苷酶，对硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷（pNP-G），pH 6.8的0.1 M磷酸缓冲液，pH 6.3的0.1 M磷酸缓冲液，牛黄胆酸钠，甘氨胆酸钠，胆酸钠，胰酶，2-氮杂（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），过硫酸钾，DPPH（1,1-二苯基-2-苦肼基），无水乙醇，盐酸，浓硫酸均为分析纯（上海麦克林生化科技有限公司）。

主要仪器设备：分液漏斗和400Y粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；KQ-500E超声清洗机（昆山市超声仪器公司）；JM-B5003电子天平（诸暨市超泽衡器设备有限公司）；FlowMem0021-HP三联高压平板膜分离设备（厦门福美科技有限公司）；HH-6S恒温水浴锅（上海拓赫机电科技有限公司）；Infinite M200 Pro酶标仪和PHS-3E pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；ZXDP-B2050恒温培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）；ZWY-240恒温震荡培养箱（上海智诚分析仪器制造有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 乌龙茶寡肽制备及残留检测

粗制：参考SALGER M［23］方法并改进，称取100.0 g粉碎茶叶，分5次加入共计1500 mL正戊烷（300 mL/次，浸提15 min/次），以脱除脂溶性成分；过滤后，再加分5次加入共计1500 mL丙酮∶水（V/V＝7∶3）（300 mL/次，室温条件下超声提取，10 min/次），过滤，合并滤液；旋转蒸发浓缩，去除丙酮，剩余水相转移至分液漏斗；依次以二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯进行液液萃取，每种溶剂萃取5次，每次200 mL；萃取后的水相再次旋转蒸发浓缩后，冻干，得粗提物。

分段：取适量所得粗提物加2.0 L水溶解，使用三联高压平板膜，依次经过1500 Da和500 Da超滤膜，保留500～1500 Da区间段，浓缩并冻干（冻干条件：-40℃预冻12 h，4 h升温至40℃，40℃干燥12 h），得“乌龙茶寡肽”，-80℃保存。

茶多酚、咖啡碱、氨基酸和总糖残留量：称取10 mg粗提物，以水溶解定容至100 mL，分别按照GB/T 8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》、GB/T 8312-2013《茶 咖啡碱测定》、GB/T 8314-2013《茶 游离氨基酸总量的测定》和DNS［24］比色法检测。

1.3.2 乌龙茶寡肽生物活性评价

（1）降血糖：α-葡萄糖苷酶抑制活性

参照 Hailong Zhang［25］和 Qianfei Huang［25,26］的方法。分别取50 μL α-葡萄糖苷酶溶液（1.0 U·mL-1）与50 μL不同浓度的寡肽粗提物水溶液（62.5、125、250、500、1000 µg·mL-1）在 96 孔板中震荡使混匀，37℃下放置10 min后，加50 μL底物（5.0 mM pNP-G）溶液，继续置于37℃下反应20 min，立即加100 µL 0.1 M Na2CO3使酶失活，终止反应，405 nm下测定吸光值。具体操作方式见表1。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制反应试剂添加量Table 1 Addition amount of α-glucosidase inhibition reagent （单位：μL）

每次试验三组平行，以样品浓度的自然对数值为横坐标，抑制率为纵坐标，建立线性方程，计算半数抑制浓度（IC50）。

公式如下：

α-葡萄糖苷酶抑制率（%）＝［1－（实验组－空白组）/（酶对照组－空白对照组）］×100%

（2）降血脂：胆酸盐法

参照李井雷［27］等人的方法。胆酸盐标准曲线：取不同浓度的标准溶液（胆酸钠25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1，甘氨胆酸钠 25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1，牛磺胆酸钠25.0、37.5、50.0、62.5、75.0 μg·mL-1）2 mL于具塞试管中，加入6 mL质量分数60%的H2SO4，于70℃水浴20 min，后冰浴5 min，在387 nm波长处测定吸光度。以胆酸盐含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘得胆酸盐含量标准曲线。

实验组：取3mL 1 mg·mL-1寡肽溶液，加入1 mL 0.01 M盐酸，3 mL胃蛋白酶溶液，37℃恒温振荡1 h后，用0.1M NaOH调pH至6.3，加入4 mL胰蛋白酶，37℃恒温振荡1 h后，再依次加入4 mL 0.3 mmol·L-1胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠溶液，37℃恒温振荡1 h，4000 r·min-1离心20 min，取上清液2 mL，加入6 mL 60% H2SO4于70℃水浴中反应20 min后，取出冰浴5 min，387 nm处检测吸光度。

空白组：3 mL PBS代替样品溶液，重复以上步骤。

各组做三个平行，通过胆酸盐标准曲线求得胆酸盐剩余含量。

公式如下：

胆酸盐结合率（%）＝［（胆酸盐加入量－胆酸盐剩余量）/胆酸盐加入量］×100%

（3）抗氧化：DPPH法

参照郑景茹［28］等人的检测方法。DPPH自由基清除能力测定：配制1 mg·mL-1寡肽溶液，稀释成62.5、125、250、500、1000 μg·mL-1的样品溶液；室温下，向96孔板的每个孔中依次加入100 μL寡肽溶液、100 μL乙醇、及100 μL DPPH溶液（237 μg·mL-1），充分混匀，避光30 min，于515 nm处测吸光度（A）；100 μL超纯水代替样液，作为空白对照（A空），每组做三个平行，谷胱甘肽标准品作为阳性对照。

DPPH自由基清除率（%）＝［（A空－A）/A空］×100%

1.4 数据处理

采用office excel和IBM SPSS Statistics 22.0对结果进行分析，利用回归分析，建立样品浓度的自然对数值——抑制率的回归曲线，计算IC50；使用最小显著性差异分析法（LSD）和Games-Howell法对实验结果进行单因素方差分析，比较实验结果的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 乌龙茶寡肽得率和纯度

以乌龙茶为原料，经过脱脂、提取、液液萃取过程，得到乌龙茶寡肽粗提物1.74 g，即得率为1.74%；粗提物经超滤过程，截取得到500～1500 Da肽段0.272 g，得率为0.27%。

茶叶中已知的主要功能性成分包括茶多酚、咖啡因、多糖类、氨基酸等，通过对茶叶寡肽粗提物中的成分进行理化检测，其中总糖残余量＜1.0%，茶多酚残余量＜0.1%，未检测出咖啡因、氨基酸。结合相关报道［23］，截取得到的500～1500 Da分子量段物质主要为乌龙茶寡肽。

2.2 乌龙茶寡肽生物活性

2.2.1 乌龙茶寡肽降血糖效果

乌龙茶寡肽的降血糖效果如图1所示，该寡肽在其测试浓度范围内均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，并且抑制率与寡肽浓度呈正相关的量效关系，各浓度之间均存在显著性差异。经拟合计算，寡肽对α-葡萄糖苷酶的IC50为0.093 mg·mL-1。

图1 乌龙茶寡肽对α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig. 1 Inhibition effect of oolong tea oligopeptides on α-glucosidase

2.2.2 乌龙茶寡肽降血脂效果

以胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠三种胆酸盐作为标准品，研究乌龙茶寡肽的降血脂效果。结果表明，胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠标准曲线拟合方程分别为：y＝0.0265x＋0.0113，R2＝0.994；y＝ 0.0203x＋ 0.0063，R2＝ 0.993；y＝0.0226x－0.0079，R2＝0.9958，均符合试验要求（图2）。1 mg寡肽可以结合（24.26±1.15）%胆酸钠、（24.10±1.15）%牛磺胆酸钠和（23.66±1.12）%甘氨胆酸钠（图3）。

图2 胆酸盐标准曲线Fig. 2 Standard curve of cholate

图3 乌龙茶寡肽对胆酸盐的结合能力Fig. 3 Cholate binding ability of oolong tea oligopeptides

2.2.3 乌龙茶寡肽抗氧化效果

如图4所示，谷胱甘肽和乌龙茶寡肽在其测试浓度范围内均可清除DPPH自由基。随着寡肽浓度的增加，对DPPH自由基的清除率也相应增加，至寡肽浓度剂量为0.7 mg·mL-1时，DPPH自由基清除率最高。经拟合计算，谷胱甘肽对DPPH自由基的IC50为0.099 mg·mL-1，乌龙茶寡肽对DPPH自由基的IC50为0.033 mg·mL-1，说明在同等浓度条件下，乌龙茶寡肽的抗氧化能力优于谷胱甘肽。

图4 谷胱甘肽和乌龙茶寡肽对DPPH自由基清除能力Fig. 4 DPPH scavenging ability of glutathione and oolong tea oligopeptides

3 讨论与结论

近年来，寡肽作为一种新型活性物质被大众熟知，主要采用酶解提取技术制得，工艺简单［14,29］，即选择合适的酶水解大分子蛋白质得到寡肽。本研究借鉴可可豆肽的制备方法，利用寡肽的化学性质，采用丙酮水溶液直接提取茶叶中天然存在的寡肽，为茶叶中天然存在的寡肽的开发研究提供一定的理论基础。茶叶富含茶多酚、茶多糖、茶色素、生物碱、氨基酸等多种生物活性成分，药理作用表现在抗氧化、体重控制、防治心血管疾病、抗糖尿病等方面，本研究采用膜分离方式制得新型活性物质——乌龙茶寡肽，并初步探索其生物学活性。

糖尿病是由于胰岛素缺失产生的代谢性疾病，并且仍是当今研究中的重点。α-葡萄糖苷酶又称为α-葡萄糖苷水解酶，可以促进体内葡萄糖的释放，从而导致血糖含量升高，抑制α-葡萄糖苷酶活性表达可有效防止血糖升高，从而调节血糖水平。试验表明，乌龙茶寡肽可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，并且随着寡肽浓度的升高，且呈现浓度依赖效应，可以实现降血糖的效果，后续研究可进一步从寡肽作用机制及具体活性结构入手，开发相关的茶叶寡肽活性产品。

另一方面，血脂水平与各类心血管疾病密切联系。高血脂多发生在老年人群体，容易引发动脉硬化，冠心病等症状。药物通过结合胆酸盐，阻止胆汁酸的重吸收，降低体内胆汁酸含量，从而促进胆固醇转化为胆汁酸，进而降低胆固醇水平。有研究表明［28］，茶叶可以与胆酸盐结合，达到降血脂的目的。本研究发现，乌龙茶寡肽对胆酸钠、甘氨胆酸钠、牛黄胆酸钠的结合能力为24%左右，作用效果较低，可能与反应时间以及寡肽浓度存在一定的量化关系，后续需进一步探讨。

目前关于茶叶抗氧化的体外实验，主要有清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子，以及铁离子还原能力等［30］。本研究检测乌龙茶寡肽清除DPPH自由基的能力，其IC50为0.033 mg·mL-1，低于阳性对照——抗氧化剂谷胱甘肽对DPPH自由基的IC50（0.099 mg·mL-1），表明寡肽的抗氧化能力优于谷胱甘肽。

综上所述，本研究初步探究了闽北乌龙茶寡肽的生物学活性，结果发现其具有较强的抗氧化活性，且具备一定的降血糖和降血脂能力，后续可进一步在寡肽氨基酸序列的基础上进行活性研究。