福建苦茶资源不同叶位儿茶素及嘌呤生物碱组分分析

曾珊珊，陈潇敏，邵淑贤，廖龙华，吴文晞，赵 峰，叶乃兴*

（1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.福建咏甘华茶业有限公司，福建 福州 350011；3.福建恒正检测技术有限公司，福建 福州 350100；4.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

茶树种质筛选对特异茶树种质资源的搜集、保存和利用有重要意义［1］。儿茶素、生物碱是茶树芽叶的主要生化成分，其组分构成及含量在很大程度上决定了茶叶品质的优劣以及适制性［2］，从而决定了茶树资源的开发利用价值，因此生化成分特异茶树品种是今后茶树育种的主要目标之一。茶叶中的儿茶素是茶叶中多酚类物质主体成分，也是茶叶品质形成的关键成分［3］。儿茶素主要分为含没食子酸基（EGCG和ECG）和不含没食子酸基（C、EC和EGC）两大类，EGCG、ECG和总儿茶素含量随着茶梢成熟显著下降, C、EC和EGC含量变化趋势相反［4］。在一般茶种植物中，嘌呤生物碱的分布模式主要是以咖啡碱为主，含有少量的可可碱和微量的茶叶碱,苦茶碱仅在部分苦茶中含有［5］。咖啡碱（Caffeine）在茶树芽叶幼嫩部位含量较高，其含量随着茶树叶片的成熟而降低，是一类重要的生物活性物质，也是茶汤中重要的呈味物质。福建野生茶树资源丰富，相关研究较多，近年来，在福建省境内陆续发现了同时富含甲基化EGCG和苦茶碱的特异茶树种质资源［6－8］。刘玉飞［9］、段志芬［10］等对云南茶树种质资源的生化成分进行分析，发现云南地方茶树种质资源的生化成分具有遗传多样性，筛选到高儿茶素指数CI、高苦茶碱、低咖啡碱等特异种质17份。陈潇敏等［11］对福建野生茶树资源嘌呤生物碱的组分构成进行测定，筛选出14份嘌呤生物碱特异的茶树种质资源。陈晓岚［12］、樊晓静［13］及王泽涵［14］等分别对福建寿宁、云霄、诏安地区野生茶树种质资源的微形态和生物学性状进行调查研究，首次在福建发现了野生秃房茶树群体种质资源,研究表明野生茶树和栽培种的叶片和花粉微形态特征存在一定的共性和特异性。

前人的研究大多是对野生苦茶资源种质的发掘及其生化成分和生物学性状的鉴定与评价［6－11］，尚未对这些苦茶资源不同叶位生化组分的分布规律进行研究，由于茶树新梢不同叶龄的叶片在发育进程中存在形态特征和生理生化方面的差异，为此，本研究以福建不同茶区的苦茶种质资源为研究材料，探究福建苦茶资源不同叶位儿茶素和嘌呤生物碱的分布规律以及不同种质间的含量差异，以期为这些特异种质资源的深入研究与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2021年4月上旬分别采集来源于福建安溪、云霄、大田等3份苦茶资源的春季第1轮新梢的第一至第四叶，以‘福鼎大白茶’为对照，采自福建农林大学南山实验茶园。采用液氮固样，以干冰保存并转运至茶学福建省高校重点实验室，冷冻干燥后粉碎过60目筛。

1.2 主要仪器与试剂

UltiMate 3000 高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Nexera X2 LC-30A高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），串联Sciex 4500 Q-Trap质谱仪（美国Sciex公司）；C18反相色谱柱（5µm、4.6×250 mm，2.6 µm、2.1×100 mm；广州菲罗门公司)；超纯水系统（Medium Touch，上海和泰仪器有限公司）。

9种儿茶素标品：表没食子儿茶素-3-O-(3-O-甲基)没食子酸酯（EGCG3"Me）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、没食子儿茶素（GC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、儿茶素没食子酸酯（CG）。4种嘌呤生物碱标品：咖啡碱（Caffeine，CAF）、可可碱（Theobromine，TB）、苦茶碱（Theacrine，TC）、茶叶碱（Theophylline，TP）。色谱纯甲醇（安谱实验科技股份有限公司）；色谱纯乙腈（上海默克化工技术有限公司）；色谱纯甲酸（国药集团化学试剂有限公司）；甲酸铵（安谱实验科技股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 儿茶素组分测定方法

采用高效液相色谱法，参照王丽丽等［15］方法稍作修改。色谱条件：C18反相色谱柱(5 μm，4.6×250 mm)；流动相A为0.2%甲酸水溶液（v:v），流动相B为甲醇；流速1.00 mL·min-1；柱温40℃；进样量10 μL；梯度洗脱条件：0～2 min，88% A；2～ 10 min，88% ～ 75% A；10～15 min，75%～73% A；15～25 min，73%～68% A；25～30 min，68% A；30～32 min, 68%～88% A。

样品前处理方法：称取0.200 g样品，加入30 mL甲醇，涡旋，超声提取30 min，冷却后于4℃、10000 r·min-1离心5 min，上清液过0.22µm有机相微孔滤膜，上机待测。

1.3.2 生物碱组分测定方法

采用液质联用方法测定，色谱柱为：C18反相色谱柱（2.6 µm，2.1×100 mm），参照陈潇敏［11］等方法。

1.4 数据处理

每个供试样品各采集3次重复，测定后，以“平均值±标准偏差”表示其含量；使用SPSS19.0软件（美国，IBM公司）和Microsoft Excel 2019（美国，Microsoft公司）进行数据处理及表格制作；以Origin 2018（美国，OriginLab公司）制作折线图。

2 结果与分析

2.1 福建苦茶资源不同叶位儿茶素总量及嘌呤生物碱总量分析

本研究对供试苦茶资源春梢不同叶位儿茶素总量和嘌呤生物碱总量进行了测定。3份福建苦茶资源及对照品种福鼎大白茶的不同叶位儿茶素总量和嘌呤生物碱总量如表1所示。结果表明，安溪、云霄、大田等苦茶芽叶的儿茶素总量和嘌呤生物碱总量差异明显，其中安溪苦茶儿茶素总量最高，其第二叶位含量为244.18 mg·g-1；安溪苦茶和云霄苦茶不同叶位儿茶素总量差异未达到显著水平。大田苦茶儿茶素总量较低，其不同叶位变化趋势与对照品种福鼎大白茶相似，均表现为第二叶与第三叶含量较高，第一叶含量显著低于第二叶与第三叶。云霄苦茶嘌呤生物碱总量最高，属于高嘌呤生物碱茶树种质，其春梢第二叶位嘌呤生物碱含量达到79.44 mg·g-1，但不同叶位之间嘌呤生物碱总量的差异未达到显著水平。大田苦茶、安溪苦茶与对照品种福鼎大白茶的嘌呤生物碱总量接近，且变化趋势一致，均表现为第一叶至第二叶呈上升趋势，而从第二叶开始递减，第二叶的嘌呤生物碱总量与第四叶的嘌呤生物碱总量均存在显著差异。

表1 福建苦茶资源不同叶位儿茶素和生物碱总含量Table 1 Contents of catechins and alkaloids in leaves located differently on Fujian bitter tea plants （单位：mg·g-1）

（接表1）

对3份福建苦茶资源及对照品种福鼎大白茶的儿茶素总量和嘌呤生物碱总量进行了双因素方差分析，结果如表2所示，不同种质间的儿茶素总量和嘌呤生物碱总量的差异达到极显著水平，不同叶位间的嘌呤生物碱总量的差异达到显著水平，而不同叶位间的儿茶素总量的差异未达到显著水平。

表2 参试种质、叶位间的方差分析检验结果Table 2 Analysis of variance on germplasms and leaf position

2.2 福建苦茶资源不同叶位儿茶素组分含量分析

本研究测定了9种主要儿茶素（色谱图见图1），其中GC、GCG和CG在3份苦茶资源和对照品种福鼎大白茶中均未检出（图2）。根据图2可知，供试茶树资源在所检测出的6种主要儿茶素组分含量配比上存在差异，儿茶素组分含量中最高的是EGCG，在3份苦茶资源的不同叶位中均检测出EGCG3"Me，而在对照品种福鼎大白茶仅在第一叶中检出EGCG3"Me。

图1 儿茶素组分标品色谱图（浓度为400 μg·mL-1）Fig. 1 Chromatogram of catechin standards（STD400）

图2 福建苦茶资源不同叶位儿茶素组分色谱图Fig. 2 Chromatogram of catechins in leaves located differently on Fujian bitter tea plants

供试茶树资源儿茶素组分在不同品种不同叶位的含量如表3所示。就不同叶位而言，EGCG和EGC含量随着叶位的增加大致呈现出先增后减的趋势，EGCG3"Me和EC含量在不同叶位呈递增趋势，而ECG和C含量则相反，呈递减趋势。就不同苦茶资源而言，云霄苦茶与安溪苦茶的儿茶素组分含量变化趋势与对照品种福鼎大白茶相似，表现为EGC和EC含量递增，C、EGCG和ECG含量递减，EGCG3"Me、C含量在云霄苦茶和安溪苦茶中呈递增趋势。而大田苦茶的儿茶素组分含量变化趋势无明显规律。

表3 福建苦茶资源及对照品种儿茶素组分含量Table 3 Catechins in leaves of Fujian bitter tea plants and control variety （单位：mg·g-1）

2.3 福建苦茶资源不同叶位嘌呤生物碱组分含量分析

本研究测定了4种主要嘌呤生物碱，即咖啡碱（CAF）、可可碱（TC）、茶叶碱（TP）和苦茶碱（TC），总离子流图见图4。其中茶叶碱（TP）在3份苦茶资源和对照品种福鼎大白茶中均未检出。云霄苦茶和大田苦茶的苦茶碱含量超过30 mg·g-1，属于高苦茶碱茶树种质。供试茶树资源在所检测出的3种主要嘌呤生物碱组分含量配比上存在差异，云霄苦茶、安溪苦茶和对照品种福鼎大白茶均是以咖啡碱为主要嘌呤生物碱，而大田苦茶的嘌呤生物碱分布模式异于其它3份茶树资源，其苦茶碱含量高于咖啡碱含量。在3份苦茶资源的不同叶位中均检测出苦茶碱，而在对照品种福鼎大白茶中未检出。就不同茶树种质而言，3份苦茶资源的嘌呤生物碱含量变化趋势与对照品种福鼎大白茶相似，表现为咖啡碱和可可碱含量递减，而苦茶碱在苦茶资源中表现为递增趋势。

图4 福建苦茶资源不同叶位嘌呤生物碱组分总离子流图Fig. 4 TIC of purine alkaloid in leaves located differently on Fujian bitter tea plants

参试茶树资源不同叶位的嘌呤生物碱组分含量如表4所示。咖啡碱含量在4份茶树资源中均呈递减趋势，且第一叶含量显著高于第四叶含量。苦茶碱含量在云霄苦茶和安溪苦茶中表现为递增趋势，而在大田苦茶中表现为先增后减。除云霄苦茶外，可可碱含量在其他3份茶树资源中呈递减趋势，而云霄苦茶的不同叶位间的可可碱含量差异很小。

图3 嘌呤生物碱组分标品总离子流图（浓度为500 μg·mL-1）Fig. 3 TIC of purine alkaloid standards (STD500)

表4 3份福建苦茶资源及对照品种嘌呤生物碱组分含量Table 4 Purine alkaloids contents in leaves of 3 bitter tea rescources of Fujian and control varirety （单位：mg·g-1）

（接表4）

3 讨论与结论

福建地处我国东南沿海，东经115°51′～120°43′，北纬 23°33′～ 28°19′之间，属于中亚热带和南亚热带气候，雨量充沛，茶树种质资源丰富，不仅拥有优异的红、绿茶和乌龙茶品种，还有大量野生茶树种质资源［16］。茶叶中的儿茶素属于黄烷醇类化合物，是茶叶的主要品质成分，对提高茶汤滋味品质有积极作用［17］。茶叶生物碱是茶树芽叶中的一类拥有共同嘌呤环结构的有机物，具苦味，与茶黄素以氢键缔合后形成的复合物呈现鲜爽味［18］，因此生物碱含量被认为是影响茶叶品质的重要因素。本研究中，安溪苦茶和云霄苦茶的儿茶素总量显著高于福鼎大白茶，属于高儿茶素茶树种质资源。云霄苦茶各叶位的嘌呤生物碱总量显著高于对照种和其他两份苦茶资源，4个叶位的嘌呤生物碱总量都高达70 mg·g-1以上，属高生物碱特异茶树种质资源。

不同茶树品种的生化成分存在差异［19］，本研究中的苦茶资源儿茶素和嘌呤生物碱含量和组成以及它们在不同叶位的分布也存在差异。本研究供试苦茶资源在所检测出的6种主要儿茶素组分含量配比上存在差异，儿茶素组分含量中最高的是EGCG，总体趋势为EGCG＞ECG＞EGC＞EGCG3"Me＞EC＞C，这与前人的研究结果一致［15］。而安溪苦茶和云霄苦茶不同叶位间儿茶素总量差异未达到显著水平，其原因是EGCG、ECG含量随着叶位递增呈现下降趋势，而EGCG3"Me、EGC含量是呈现上升趋势。值得注意的是，3份苦茶资源的不同叶位中均检测出较高含量的EGCG3"Me（＞1%），EGCG3"Me是茶叶中甲基化儿茶素化合物，具有抗过敏、改善肠道、预防糖尿病、防肥胖、降血压、保护肝脏等保健功效［20－25］，与其他类型的儿茶素相比具有更强的抗过敏作用，且在动物血液中更加稳定，口服吸收率比EGCG高9倍［26］，前人研究表明，随着叶片成熟度的增加，茶叶中EGCG3"Me的含量有增加趋势，一般来说，茶树新梢的第三叶或者第四叶含量达到最高水平［27］,这与本实验结果一致。本研究筛选获得的高EGCG3"Me茶树种质资源，为其之后的开发利用奠定基础。

在现有生产上的茶树栽培品种中，茶树嘌呤生物碱的分布模式主要是以咖啡碱为主，含有少量的可可碱和微量的茶叶碱。前人研究发现含有苦茶碱的野生茶树或者茶树野生近缘种资源研究主要集中于广东、江西、贵州、云南等地区，近年来福建地区含苦茶碱的野生资源被挖掘，陈潇敏等首次发现了福建含有苦茶碱的特异资源——蕉城苦茶，并初步探究了其苦茶碱形成的分子机理［29］。云霄苦茶和安溪苦茶春梢随叶位增加，其苦茶碱含量呈递增趋势，与滕杰等［30］关于秃房茶的研究结果一致。然而大田苦茶不同叶位苦茶碱含量的变化趋势有别于云霄苦茶和大田苦茶，表现为先增后减的趋势，与李红建等［31］关于广东苦茶资源的研究结果类似，可能是茶树种质间的基因型造成的差异。本研究的福建苦茶资源在所检测出的3种主要嘌呤生物碱组分含量配比上存在差异，云霄苦茶、安溪苦茶和对照品种福鼎大白茶均是以咖啡碱为主要嘌呤生物碱，而大田苦茶的苦茶碱含量显著高于咖啡碱含量，属于高苦茶碱低咖啡碱的特异茶树种质，该种质的品质化学特征有待进一步深入研究。