青海玉树牦牛源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性研究

吴 丹，罗润波，黄家旗，刘安静，夏子涵，吕家煌,，李 彬，宋仁德，索朗斯珠*

(1.西藏农牧学院 动物科学院，西藏 林芝 860000；2.江苏农业科学研究院 兽医研究所，江苏 南京 210014；3.国家肉牛牦牛产业技术体系玉树综合试验站，青海 玉树 815000)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens，C.perfringens)旧称魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)是一种可同时感染人和动物的人兽共患性条件致病菌[1]，广泛存在于泥土、污水、腐殖质、饲草、排泄物等自然环境中以及人兽肠道中[2]，是人和动物的肠道正常菌群成员。其分泌的4种常见毒素(α、β、ε、ι)将其分成5个亚型(A、B、C、D、E)[3]。根据研究报道[4-5]，其中A型菌分泌α毒素，主要引起人食物中毒；B型菌分泌α、β、ε 3种毒素，主要引起新生羔羊痢疾；C型菌分泌α、β 2种毒素，主要引起牛羊猝狙、禽类坏死性肠炎、新生反刍动物肠毒血症、仔猪红痢；D型菌分泌α、ε 2种毒素，主要引起牛羊肠毒血症、羊急性或慢性致死；E型菌分泌α、ι 2种毒素，主要引起犊牛和羔羊的痢疾、肠毒血症。

据报道[6-7]，牦牛以放牧为主，消毒防疫措施难以实施，每年春、秋季由产气荚膜梭菌引起的牦牛疫病时有发生，常年影响着牦牛产业的稳定发展。为研究玉树地区牦牛群中产气荚膜梭菌的流行情况，采集了当地牦牛腹泻样品进行了细菌的分离鉴定和致病性以及耐药性研究。

1 材料与方法

1.1 样品来源2020年10月，青海省玉树藏族自治州的治多县、杂多县和称多县等地区出现了大批牦牛腹泻、精神不佳、食欲下降的症状，且经过青霉素、链霉素、四环素等药物治疗效果不明显，初步怀疑为产气荚膜梭菌感染。国家肉牛牦牛产业技术体系玉树综合试验站工作人员从该地区采集148份新鲜牦牛腹泻粪便并及时送检。

1.2 主要试剂液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TSC)、梭菌增菌培养基(RCM)、营养琼脂培养基(NA)、羊血琼脂培养基、厌氧肉汤培养基(FT)、DL2000 DNA Marker、2×Taq Master Mix酶均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；生化鉴定管、药敏片购自杭州微生物试剂公司生产；无菌脱纤维绵羊血购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验动物昆明系4周龄SPF级小鼠80只，体质量18～22 g，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司。

1.4 细菌的分离纯化将粪样接种于FTG培养基厌氧培养16 h，选取其中大量产气的样品，转接至TSC培养基。挑取黑色扁平圆形的单菌落接种于RCM，增菌培养后采用分区划线法接种于绵羊血琼脂平皿上，再挑取有溶血环的单菌落，继续纯化3次。挑取纯化后的单菌落进行革兰染色镜检。

1.5 生化试验参考伯杰细菌鉴定手册[8]，利用葡萄糖、硝酸盐、乳糖、吲哚、水杨酸、明胶、果糖、麦芽糖、蔗糖、酪蛋白等细菌生化鉴定管，对分离菌进行生化鉴定。

1.6 分离菌16S rRNA基因PCR鉴定参照文献[9]方法合成细菌16S rRNA引物对目的基因进行扩增，F：5′-GGAGGCAGCAGTGGGGAATA-3′，R：5′-TGACGGGCGGTGTGTACAAG-3′。PCR扩增体系(50 μL)：上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix酶25 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。将PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将符合目的条带大小的PCR产物进行基因组回收，委托擎科生物科技有限公司进行测序。

1.7 多重PCR毒素分型鉴定参照文献[10]方法合成产气荚膜梭菌的4种主要毒素基因引物，见表1。多重PCR扩增体系(50 μL)：上、下游引物各1 μL(共4对，见表1)，2×Taq Master Mix酶25 μL，模板2 μL，ddH2O 15 μL。多重PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

色谱柱 YMC-C30：4.6×250mm，5μm；检测波长：445nm；柱温：35℃；流动相：甲醇∶水=95∶5，等梯度洗脱；流速：0.8mL/min；进样量：20μL。

表1 产气荚膜梭菌多重PCR引物信息

1.8 分离株同源性及进化树分析将分离菌的16S rRNA序列利用SeqMan 5.01软件对峰图分析，并对序列做拼接、剪切处理。随后与GenBank中经典序列进行核酸比对，利用MEGA 7.0软件采用邻接法(Neighbor Joining)构建分离菌的16S rRNA系统遗传进化树。

1.9 药敏试验及耐药基因检测

1.9.1药敏试验 采用世界卫生组织(WHO)推荐的Kirby-Bauer纸片扩散法测定14株分离菌对22种抗菌药物的敏感性。并根据抑菌圈大小，参照CLSI推荐的《抗菌药物敏感性试验执行标准》对分离菌的耐药情况进行判定[11-12]。

1.9.2耐药基因检测 参照文献[13-14]合成耐药基因引物，见表2。PCR扩增体系(50 μL)：上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix酶25 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL。

表2 耐药基因引物信息

1.10 分离菌株动物试验

1.10.1分离菌外毒素动物致死性毒力试验 选取1株A型菌YS-1(MW980090)和1株C型菌株YS-6(MW980095)接种于绵羊血平板，挑取单菌落接种于灭菌厌氧肉汤中，43℃振荡培养8～10 h，12 000 r/min离心15 min，用0.22 μm孔径细菌滤器过滤，下清液即为分离菌的外毒素滤液。按照2倍倍比稀释得到20，2-1，2-2，2-3，2-4，2-56个梯度的浓度，并用血平板作无菌检验。以5只小鼠为1组，每只腹腔注射0.5 mL外毒素滤液，对照组注射等量的无菌肉汤。注射接种后，放回原笼，密切观察，并连续记录小鼠3 d内的死亡情况。

1.10.2分离菌活菌动物致病性试验 选取1株A型菌YS-1(MW980090)和1株C型菌株YS-6(MW980095)挑取单菌落接种于灭菌厌氧肉汤中，37℃厌氧培养16～18 h。离心后，用生理盐水替换培养液，通过平板计数法调整菌液浓度，使其达到108CFU/mL。将小鼠分为5只1组，通过腹腔注射法给每只小鼠注射1 mL菌液，对照组注射等量的无菌生理盐水。注射接种后，放回原笼，观察并连续记录小鼠3 d内的死亡情况。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果经分离鉴定培养共得到疑似产气荚膜梭菌14株。分离菌在FTG中(图1 A)快速产生大量气体。在TSC中(图1 B)长出带乳白色晕圈的黑色单菌落。在血平皿上(图1 C)长出具有典型的双溶血环的表面光滑、边缘整齐、近似透明的菌落。在含铁石蕊牛乳中(图 1 D)可观测到暴烈发酵现象。经过革兰染色镜检(图1 E)可见菌体粗短、成单个或双个排列的革兰阳性直杆菌。

A..FTG培养基；B.TSC培养基；C.绵羊血平板培养基；D.石蕊牛乳培养基；E.革兰染色(1 000×)

2.3 分离菌16S rRNA PCR鉴定结果分离菌的16S rRNA基因PCR产物凝胶电泳后在1 034 bp处出现条带(图2)。在NCBI网站上的Nucleotide数据库中比对结果显示，14株分离菌与C.perfringens相似性达99.5%～100%。将14株分离菌序列上传至GenBank获得登录号，YS-1～YS-14依次为MW980090～MW980103。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～15.分离菌YS-1～YS-14

2.4 分离菌多重PCR分型鉴定结果多重PCR检测结果显示，14株分离菌均含有α毒素(325 bp)，其中4株(还含有β毒素(196 bp))。由此判定，10株为A型产气荚膜梭菌，4株为C型产气荚膜梭菌。分离菌多重PCR分型凝胶电泳结果见图3。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～15.分离菌YS-1～YS-14

2.5 16S rRNA PCR同源性进化树分析14株分离菌相互比对后，选择YS-1(MW980090)、YS-4(MW980093)、YS-6(MW980095)、YS-13(MW980102)与在 GenBank 中典型的具有参考价值的菌株与分离株的序列一起构建系统进化发育树，结果见图4。YS-1(MW980090)与印度豹源(MN326666.1)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性，YS-4(MW980093)和YS-13(MW980102)为单独的一枝与其他来源的产气荚膜梭菌具有一定的遗传差异性，YS-6(MW980095)与北京人源(KP944154.1)产气荚膜梭菌具有相似性。

图4 部分分离菌16S rRNA遗传进化树分析

2.6 药敏试验及耐药基因检测结果

2.6.1药敏试验结果 结果显示，分离菌对复方新诺明、多黏菌素、青霉素、多西环素、四环素表现出不同程度的耐药；对克林霉素、氯霉素、万古霉素、氧氟沙星敏感；对β-内酰胺头孢类和β-内酰胺青霉素类(除青霉素)表现出不同程度的敏感。

2.6.2耐药基因检测结果 含耐药基因的菌株PCR检测结果见图5。结果显示，YS-10(MW980099)、YS-11(MW980100)含有抗大环内酯类ermB基因(图5A)，检出率14.3%；YS-8(MW980097)、YS-9(MW980098)、YS-12(MW980101)、YS-13(MW980102)含有抗四环素类tetM基因(图5 B)，检出率28.6%；YS-13(MW980102)、YS-14(MW980103)含有抗β-内酰胺类blaTEM基因(图5 C)，检出率14.3%，其结果与药敏试验结果基本一致。

A..抗大环内酯类ermB基因；B.抗四环素类tetM基因；C.抗β-内酰胺类blaTEM基因

2.7 分离菌外毒素毒力测定外毒素攻毒试验结果见表3。A型菌YS-1(MW980090)的外毒素对小鼠具有致病但致死性不强，未见致死亡；C型菌YS-6(MW980095)的外毒素在稀释24倍后仍然对小鼠致死率达到了60%，在稀释25倍后不再对小鼠致死。

表3 外毒素攻毒试验结果

2.8 分离菌动物致病性试验A型菌YS-1(MW980090)攻毒后见图6A，可明显观察到小鼠食欲减退、流泪、眼睑下垂、阴道出血、精神状态不佳、逐渐出现神经症状、腹部胀大，72 h内全部死亡。C型菌YS-6(MW980095)攻毒后见图6B，小鼠很快出现神经症状，行动迟缓，24 h内全部死亡。对死亡小鼠解剖发现(图7，8)，A型菌YS-1(MW980090)和C型菌YS-6(MW980095)组均出现全身性病理变化，各种组织器官均有不同程度的出血、病变，胸腹腔内出现红色积液。大脑淤血、脑积液增多；小肠出血；肝脏、肾脏、脾脏出血呈暗红色；心脏、肺脏、胃未见明显病变。对照组小鼠腹部未见肿胀，剖检后未见异常。对死亡小鼠病变组织进行涂片，可见有革兰阳性短杆菌大量存在，将其进行分离鉴定仍为产气荚膜梭菌，对照组未分离到产气荚膜梭菌。

A..A型组小鼠慢性死亡；B.C型组小鼠急性死亡

A..空白对照组小鼠；B.A型菌攻毒组小鼠；C.C型菌攻毒组小鼠

3 讨论

近年来有关产气荚膜梭菌引起牦牛感染的报道[4,6-7]时有出现，通常认为一些动物的坏死性肠炎、下痢、气性坏疽与A型产气荚膜梭菌感染有关，一些动物的肠毒血症、红痢、猝疽与C型产气荚膜梭

图8 各组小鼠脏器图

菌感染有关。本试验由研究人员从青海玉树地区采集牦牛新鲜腹泻粪样，对其分离培养、革兰染色镜检、16S rRNA鉴定、多重分型鉴定，确认分离到了14株产气荚膜梭菌。分型结果显示，10株为A型产气荚膜梭菌，4株为C型产气荚膜梭菌。此牦牛源产气荚膜梭菌所含毒素型的结果与近年来罗润波等[15]从西藏那曲地区的牦牛源样品中分离到的产气荚膜梭菌毒素型结果相符合。

本试验将分离株序列上传至GenBank，并与GenBank中具有价值性的产气荚膜梭菌序列作比对构建系统遗传进化树。所分离的青海玉树地区牦牛源产气荚膜梭菌与西藏那曲安多、班戈等地牦牛源产气荚膜梭菌具有一定的遗传差异。通过比对发现，其中YS-1(MW980090)与印度豹源(MN326666.1)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性，YS-4(MW980093)和YS-13(MW980102)分别为单独的一枝具有一定的变异性，YS-6(MW980095)与北京人源(KP944154.1)产气荚膜梭菌具有相似性。YS-1(MW980090)与印度豹源(MN326666.1)产气荚膜梭菌具有非常高的亲缘性，其原因可能是印度与中国青藏高原接壤，可能有部分野生动物活动于这两地。由于产气荚膜梭菌从最初的野生动物中的流行逐渐传播到家畜当中，在我国新疆也有野猪暴发产气荚膜梭菌的报道[15]，因此YS-1(MW980090)的遗传差异应引起密切关注。YS-4(MW980093)和YS-13(MW980102)均有差异，一方面可能是由于青海玉树地处青藏高原，其海拔高、环境差、气候恶劣，细菌为了适应生存而导致变异；另一方面由于牦牛是一种长期生活于高寒地区的动物，有别于其他常见家畜。YS-6(MW980095)与北京人源(KP944154.1)产气荚膜梭菌具有相似性提示我们，产气荚膜梭菌为人兽共患病原菌，能引起人食物中毒，为防止在人与动物之间的传播，需做好养殖人员防护和环境卫生的消杀工作。

本研究对14株分离菌做了22种药物的敏感性测试和耐药基因检测。药敏试验结果显示，分离菌对复方新诺明、多黏菌素、青霉素、四环素、强力霉素、多西环素表现出耐药；对克林霉素、氯霉素、万古霉素、氧氟沙星表现出敏感。耐药基因检测显示，仅检出3种耐药基因，其中含有抗大环内酯类ermB基因检出率为14.3%(2/14)，含有抗四环素类tetM基因检出率为28.6%(4/14)，含有抗β-内酰胺类blaTEM基因检出率为14.3%(2/14)。由此可知，药敏试验结果与耐药基因检测结果基本吻合，造成此现象的原因可能是由于该地区长期频繁使用青霉素、四环素、多西环素等药物。根据药敏试验结果，针对青海玉树地区牦牛产气荚膜梭菌病推荐使用克林霉素、氯霉素、万古霉素、氧氟沙星等药物进行防治，避免使用复方新诺明、多黏菌素、青霉素及四环素类药物。另外，产气荚膜梭菌对氨基糖苷类药物存在天然耐药性，同样不推荐用于产气荚膜梭菌病的防治。总之，产气荚膜梭菌病传染性强，发病快，通常来不及治疗，建议临床用药中联合、交叉使用敏感性较高的药物以及中西医结合治疗、藏西医结合治疗[16]等手段。

在外毒素致死性试验中，A型菌YS-1(MW980090)外毒素未表现出致死性，可能是本试验所使用A型菌为肠道常在菌，也有可能是毒性小，攻毒剂量不够造成；C型菌YS-6(MW980095)外毒素表现出强致死性，在稀释了24倍后仍对小鼠致死。在菌体致病试验中，A、C型菌株均表现出致病性，A型菌攻毒后小鼠72 h内全部死亡，C型菌攻毒小鼠后24 h内全部死亡。通过病理解剖可以看到A、C型菌株均在大脑、小肠、肝脏、肾脏、脾脏出现不同程度病变；在心脏、肺脏、胃未见明显病变。由此可知，试验所用牦牛源A、C型产气荚膜梭菌菌株均具有强的致病性，在日常养殖中应改善饲养条件、减少养殖密度、控制环境卫生，及时按质按量注射疫苗，增强牛群免疫力。尽量避免因环境变化、体质下降、天气骤变时该菌大量增殖而导致疫病的发生。