犬乳腺肿瘤标志物的研究现状

郑慧华，张玉珠，高文睿，唐欣悦，杜崇涛，谢光洪

(吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062)

随着犬的寿命延长，癌症的发病率也随之增加。乳腺肿瘤是母犬中最常见的肿瘤，其中约50%是恶性的，其病因尚不清楚[1]。目前为止，唯一有效的治疗方法是手术切除术，包括乳房全切和局部肿瘤切除。通常，还会同时进行子宫卵巢切除术(ovariohysterectomy,OHE)，但OHE并不是对所有犬都有预防乳腺肿瘤的作用[2]。在大多数恶性肿瘤病例中，还需要进行化学治疗或放射治疗。然而，这2种治疗方法费用高，而且对犬乳腺肿瘤(canine mammary tumor,CMT)疗效的信息也很有限[3]。因此，早期发现CMT对患犬的预后至关重要，而肿瘤标志物对此可以提供有用的信息，其评估可能是肿瘤早期诊断和评估疾病进展及其对化疗反应的里程碑[4]。不幸的是，临床上对CMT标志物知之甚少。故本文简要介绍了CMT常见的标志物。

1 癌细胞增殖和凋亡的标志物

肿瘤细胞增殖活性的预测有助于判断肿瘤的恶性程度，且高增殖率与肿瘤生长速度和转移侵袭密切相关。增殖细胞核抗原(Ki-67)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和基质细胞蛋白(POSTN)是肿瘤细胞增殖的标志物，而肿瘤抑制蛋白p53(tumor protein p53,p53)是肿瘤细胞转化和凋亡的标志物。

1.1 Ki-67作为CMT最常用的预后标志物，Ki-67是一种非组蛋白性核蛋白，其表达仅限于细胞增殖周期的G1、S、G2和M期[5]。它是一种血清或细胞标志物，可以在犬乳腺细针活检的细胞学样本中进行评估，这为肿瘤的早期诊断提供了选择。有研究表明，CMT血清中Ki-67水平与肿瘤病理学等级呈正相关，而在健康犬中未检测到[6]。免疫组化(IHC)检测Ki-67表达情况，结果表明恶性CMT的Ki-67水平明显高于良性肿瘤，且与肿瘤转移、预后不良、生存时间短呈正相关；Ki-67在临床和组织病理学特征较差的肿瘤中表达量高，如体积大、伴随乳腺炎症及溃疡、侵犯周围组织、存在淋巴结转移的肿瘤[5]。目前，这一肿瘤标志物存在广阔的应用前景，但仍需要在同质性更高的群体中做进一步的研究。

1.2 PCNA作为增殖指数(proliferation index,PI)的一个标志物，PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，在细胞分裂的DNA合成期表达于细胞核，并参与DNA修复、细胞周期控制、染色质组装和RNA转录[7]。PCNA在CMT病例中高表达，且在肿瘤恶性程度高、肿瘤体积大、皮肤溃疡、组织学分级Ⅱ或Ⅲ级以及存在区域淋巴结转移的肿瘤中表达更强。BORGHESI等[8]研究证实，PCNA在非肿瘤性邻近组织中的表达量低于肿瘤组织，表明肿瘤存在早期微转移和更高的侵袭性，这一点在组织学上也得到了证实。由此可判断，PCNA的高表达与预后不良和存活率降低有关。但细胞因子刺激也可能导致PCNA表达升高，故建议结合Ki-67来评估PCNA的表达。

1.3 POSTN成纤维细胞(CAF)是一种在肿瘤基质中发现的、与癌症相关的细胞，其在血管生成中起作用，并可增加细胞迁移，从而促进肿瘤的生长、发展以及转移。作为CAF等癌症间质细胞的标志物之一，POSTN是一种参与肿瘤转化过程的蛋白质，在人类的各种类型癌症中都发现了高水平的POSTN。BORECKA等[9]研究证明了POSTN可以在CMT中表达，且表达水平与肿瘤病理学等级和Ki-67的表达呈正相关，表明POSTN可能会影响肿瘤的侵袭性并参与乳腺肿瘤的发展。因此，POSTN可能是评估CMT癌变间质的有用标志物，并具有判断预后的意义。

1.4 p53p53作为细胞致瘤性转化、细胞分裂和凋亡的重要标志物，负责调控细胞周期和细胞凋亡，是必要的肿瘤抑制因子。在肿瘤形成过程中，p53积聚在肿瘤组织中，由于其基因突变，开始发挥癌基因的作用。p53基因突变在CMT中比较常见，且与肿瘤发展有关，突变型p53的高表达通常提示预后不良以及存活率降低[10]。KLOPFLEISCH等[11]研究表明，大型犬的p53表达较高，表明可能存在可遗传的基因突变和品种易感性。但也有研究表明p53突变对肿瘤发展及患犬存活率的影响并不明显[12]，因此，p53作为CMT的预后标志物尚需进一步的研究。

2 肿瘤转移潜能的标志物

另一组重要的标志物是某些指示肿瘤转移潜能的标志物。肿瘤转移的能力取决于细胞与彼此或邻近组织的黏附，而黏附强度是通过参与这些过程的蛋白质的表达水平来衡量的。黏附分子有多种类型，如整合素、选择素、免疫球蛋白样颗粒和钙黏附素。钙黏附素是一种钙依赖的跨膜蛋白，是评价肿瘤转移的良好指标。此外，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和糖链抗原15-3(carcinoembryonic antigen,CA15-3)是参与细胞内黏附的糖蛋白，是最常被评估的乳腺癌生物标志物之一。

2.1 上皮钙黏素(E-cadherin)E-cadherin是一种细胞黏附分子，负责维持上皮组织的结构和功能完整性[13]。其基因CDH1 SNP rs850805755，rs852280880和rs852639930与CMT的低风险和低侵袭性临床病理特征之间存在关联[14]。且E-cadherin的低表达与肿瘤的发生、恶性程度、转移侵袭和总生存时间短有关[15]。E-cadherin与β链蛋白(β-catenin)连接形成络合物，络合物的任何功能障碍都会降低细胞黏附能力，进而促进肿瘤转移[13]。E-cadherin在患犬中的表达与预后不良具有相关性，但应与Ki-67一起评估。

2.2 CEACEA是一种参与细胞内黏附的糖蛋白，由胃肠黏膜产生，定位于上皮细胞膜，在结肠、乳腺和肺部的癌细胞中过度表达，且是最早发现的乳腺癌生物标志物之一。有研究证实在正常犬血清中也可以检测到CEA，但患乳腺肿瘤犬的CEA浓度更高，且存在显著性差异[16]。事实上，CEA既不是CMT初步诊断的特异性标志物，也不是敏感性标志物，但可以作为辅助标志物检测CMT。其可以用作早期发现转移的标志物，但不能用于确诊，要确定其在兽医临床上的应用，还需要进一步的研究。

2.3 CA15-3CA15-3是一种跨膜糖蛋白，是Muc1基因的产物，表达在腺上皮细胞的顶端。研究表明血清CA15-3与犬的肿瘤组织学等级呈正相关，其高水平与临床分期差、预后不良有关，此外，研究证实乳腺癌的肿瘤大小、皮肤溃烂、坏死、炎症和组织学类型与血清CA15-3水平无关。且患病犬与健康犬之间存在显著性差异[16]。CA15-3是乳腺癌患者中应用最广泛的血清标志物，对CMT的预后具有重要意义。由于CA15-3比CEA更为灵敏，同时检测两者可以提高诊断准确性，有助于选择确切的辅助治疗方法。

3 血管生成的标志物

每一个肿瘤生长发展过程都包括在原有血管的基础上形成新的血管，这对为肿瘤提供营养物质和维持组织内环境平衡尤为重要。随着肿瘤的生长，血管生成过程也随之推进。因此，这些标志物对于确定肿瘤是否生长或转移是至关重要的。

3.1 血管内皮生长因子(VEGF)VEGF可以控制血管生成，是人类医学中最常用的标志物。VEGF是由4个基因VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D编码的蛋白质，与血管和淋巴管生成密切相关。在人类医学中，VEGF过度表达与肿瘤的生长和转移有关，而其下调则会抑制肿瘤发展[17]。在CMT中，组织中VEGF蛋白表达与患病犬的年龄、肿瘤大小无关，而与淋巴结转移有关；血清中VEGF水平升高与临床分期差、预后不良、生存率低呈正相关，通常在恶性程度较高且有浸润性生长的患犬中升高，这就是其被认为是肿瘤发展和转移的标志的主要原因[8,18]。总之，VEGF是一种很好的血清和细胞标志物，且对早期发现CMT特别有用。

3.2 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR、ErbB-1或HER1)EGFR是一种跨膜型酪氨酸激酶受体，属于人表皮生长因子受体(HER)家族。恶性肿瘤中的EGFR被认为是癌细胞迁移和侵袭的促进剂，已有研究揭示了EGFR在恶性CMT发展和疾病进展中的作用，其在肿瘤组织中的高表达与肿瘤体积大、肿瘤坏死、高分裂指数、肿瘤恶性程度的组织学分级和不良的临床分期相关，与年龄也有一定的关联[19]。EGFR还可以调节VEGF的合成和分泌。也有关于EGFR抑制剂在CMT治疗中作用的研究，单独使用EGFR抑制剂或联合环氧化酶-2(cyclooxygenase 1,COX-2)抑制剂可能是晚期恶性CMT的良好治疗选择[19]。

3.3 人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)HER-2也被认为是重要的肿瘤标志物，具有调节肿瘤细胞生长、存活和分化的功能，可以在大约30%的CMT中表达，且在血清和组织中呈正相关[20]。其表达水平与肿瘤体积、有丝分裂指数和组织学分级呈正相关，被认为是预后不良的标志[21]。但是也有研究存在不一致的结果，HER-2在良性肿瘤和恶性肿瘤中的表达没有差异，甚至表达HER-2的恶性肿瘤犬比HER-2阴性犬显示出更长的存活率[22]。因此，HER-2可能参与肿瘤的形成，但不一定参与其恶性转化，或者至少不是一个良好的恶性肿瘤标志物，但对此还需进一步研究。

4 激素受体

雌激素(ertrogenreceptor,ER)和孕激素受体(progestronereceptor,PR)是研究最多的CMT生物标志物，对于正常乳腺组织的生长和发育是必不可少的，同时对肿瘤的生长也有一定的影响[22]。大多数乳腺肿瘤可以表达ER和/或PR，且催乳素和生长激素也参与肿瘤的生长过程。通常，ER和/或PR的表达在良性肿瘤中更为常见，其表达与预后良好有关[23]。但也有研究发现，患恶性肿瘤犬中ER、PR和催乳素的表达水平升高[24]。在患犬ER和PR的检测结果中发现，ER和PR+型CMT的临床预后比ER+和PR+型差，但ER-和PR-型的预后是最差的[25- 26]。尽管有研究建议使用安全剂量的他莫昔芬治疗CMT[27]，但关于这种选择性雌激素受体调节剂治疗CMT的疗效还需要进行更多的研究。

5 COX-2

环氧化酶催化蛛网膜下腔酸合成前列腺素，前列腺素E2形成的酶途径失调与肿瘤进展密切相关。许多研究证实了COX-2可以在CMT以及一些正常乳腺组织中表达，且在恶性肿瘤组织病理学分级之间存在显著性差异[26,28-29]。在CMT小鼠模型中证明COX-2抑制剂可抑制肿瘤生长，体外试验进一步证明了COX-2抑制剂可以诱导CMT细胞呈依赖性凋亡[28,30]。COX-2在恶性CMT中的表达高于良性肿瘤，可以用COX-2抑制剂治疗，如美洛昔康或吡罗昔康，但是其抗增殖作用的机制仍不清楚[29]。为了能达到良好的治疗效果，必须提前检测COX-2在肿瘤中的表达。

6 乳腺癌1基因和2基因突变(BRCA1、BRCA2)

在多种基因突变中，BRCA1和BRCA2突变在CMT形成中起着非常重要的作用。尽管CMT的遗传模式仍在调查中，但有几个品种被认为易患病，且在与乳腺癌相关的10个不同基因突变中，只有BRCA1和BRCA2与肿瘤的发生显著相关[31]。BRCA1与恶性肿瘤密切相关，而BRCA2在良性和恶性肿瘤中的表达并无明显差异[32]。然而，另一项研究发现，与正常乳腺组织相比，BRCA2在CMT中的表达减少[33]。尽管BRCA1和BRCA2已进行了多项研究，但目前对他们的确切突变以及在CMT中表达降低的作用机制仍知之甚少，还需进一步的研究。

7 MicroRNA(miRNA)

miRNAs是一种小的非编码分子，参与转录后基因表达的负调控。其表达水平在不同类型的癌症中都会发生变化，可以作为癌基因或抑癌基因发挥作用，且几乎参与了所有重要的细胞过程，如调节细胞增殖、分化、血管生成、迁移和凋亡[34-35]。既可以作为血清生物标记物，也可以作为组织生物标志物。

目前，有研究对CMT组织中miRNA表达水平进行了分析，10个与人类乳腺癌有关的miRNAs中有9个在CMT中具有相同的表达模式，且不同肿瘤类型的miRNA表达模式不同[34]。最近研究表明患乳腺肿瘤犬的血清miR-19b和miR-125a明显高于正常犬，且miRNA在转移性和非转移性肿瘤中的表达存在显著性差异，是一种良好的转移生物标志物[36]。JAIN等[16]证明了miR-21过表达和miR-29b下调与CMT的临床分期有关，可作为早期诊断和预后的标志物。评估miRNA是一种新颖且有效的癌症诊断方法，因此，基于miRNA的药物研发可能是一种具有广阔应用前景的靶向治疗肿瘤的方法。

8 肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)

CSCs也被称为肿瘤起始细胞，是一小部分具有自我更新能力的肿瘤细胞，也可以分化为不同的癌细胞。其被认为是药物、化疗和放疗耐药、肿瘤复发和转移的罪魁祸首，也是正常干细胞恶性转化、成熟癌细胞去分化或诱导多潜能癌细胞的结果，而鉴定和分离这些细胞已经成为新的治疗策略的机会[37]。已有研究表明，犬乳腺CSC表达与人乳腺CSC相似的表面标志，并且对化疗和放疗具有抗药性[38]。CD44+/CD24-表型CSCs与组织学分级高的犬乳腺癌相关[39]。在另一项研究中，在从不同CMC细胞系分离的犬CSCs中发现33个miRNAs显著减少[37]。由于犬乳腺CSCs与人乳腺CSCs具有相似的生物学行为，因此对犬乳腺CSCs模型的研究可能有助于乳腺癌的研究。然而，由于缺乏一种通用的CSC检测方法，加之CSCs表型的多样性及其异质性和动态性，使得其作为一种诊断工具的开发难以预测和评估。

9 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)

CTCs是外周血中发现的肿瘤细胞，起源于原发肿瘤或其转移瘤，故具有特定肿瘤类型的抗原性或遗传学特征[40]。CTCs对远端转移的发展是必要的，因此它们可能作为肿瘤转移潜能的标志物发挥着重要作用。尽管已发现了一组潜在CTC，但到目前为止只进行了几项研究，利用DNA微阵列[41]，通过表达6个特异性基因来鉴定CTC，发现CRYAB基因对CTC检测具有最高的特异性和中等的敏感性[42]。要了解这些有前景的标志物的用处，还需要进一步的研究。然而，CRYAB是检测CMT转移犬中CTCs的一种良好的标志物。

10 总结

在过去的几十年里，已经有许多关于犬乳腺肿瘤标志物的研究。然而，目前还没有找到理想的标志物，一个理想的生物标志物应该易在血液中检测，且浓度只在恶性肿瘤病例中升高；其次，应具有肿瘤特异性，其评估能够给予明确的预后。血清标志物比组织标志物更具优势，因为其评估过程是非侵入性的，并且在临床症状出现之前就能显示出生理和病理状态的动态变化，故可用于癌症的早期检测。综上所述，应结合临床病理特征及组织学分级对犬乳腺肿瘤进行诊断和预后。因此，生物标志物的检测是目前及未来的发展趋势。