蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡生长性能、血清指标及免疫器官指数的影响

李园园，李 震，莫庆楠，卢凤兰，周洁蕊，臧一天，吴红翔

(江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 332045)

随着畜牧业的迅速发展，蛋白质饲料资源的短缺已成为制约养殖业发展的关键，急需研究开发新的蛋白质饲料。蚯蚓是一种极具开发潜力的动物性饲料蛋白源。有研究表明，蚯蚓的蛋白质含量为56.5%，最高可达71%，含17种氨基酸以及磷、钙、硒等矿物质、维生素及微量元素[1]。此外，还含有许多核苷酸、酶类、抗菌肽、活性物质及某些生长因子，这些物质可以增强动物的免疫功能及抗病力，促进机体新陈代谢，提高生产性能[2-6]。据有关报道，蚯蚓消化道中有十多种蛋白水解酶如蚯蚓纤溶酶等，这些蛋白酶类对蛋白质有较强的水解活性，可使蛋白质发生水解作用，选择适宜的酶解条件，使蚯蚓体内酶保持较高活性，并利用这些酶水解体蛋白，使之变成可溶性的小分子活性肽和氨基酸，作为添加剂可以直接被其他动物体完整吸收[7-8]。有报道用蚯蚓粉饲喂动物，发现其可以明显提高动物的生产性能和免疫性能，增加经济效益[9-10]。孙茂红等[11]在柴鸡饲粮中添加一定水平的蚯蚓粉，发现蚯蚓粉可以通过调控血液激素水平提高柴鸡的生长性能和饲料转化率，并具有一定的降血脂功效。但目前有关蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡的研究却较为少见。

安义瓦灰鸡原产于江西省安义县东阳镇，具有耐粗饲、适应性强、抗病性强、肉质细嫩等特点[12]。是我国唯一以“灰羽”为特征的珍稀地方鸡种，属于肉蛋兼用型[13]。但由于其生长速度慢且饲养周期长，所以导致其推广受到了一定地限制。且目前有关蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡的生产性能、血清指标及免疫器官等影响的系统报道较少。因此，本试验以120～162日龄的安义瓦灰鸡(母鸡)为研究对象，研究蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡生长性能、血清指标及免疫器官指数的影响，为蚯蚓发酵液在安义瓦灰鸡生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料安义瓦灰鸡购自江西安义龙富山实业公司；蚯蚓发酵液：浙江倍康生物科技有限公司，经过高温发酵后获得。经检测分析，蚯蚓发酵液的pH值 6.02，原质量浓度中蛋白质含量10.59 g/L、氨基酸总量(17种) 12 590.9 mg/L、钙 476.10 mg/L、镁 68.00 mg/L、铜 0.071 mg/L、锌 3.07 mg/L、铁 8.90 mg/L、锰 5.90 mg/L、维生素A 300 mg/L、维生素D 37.2 mg/L、维生素E 0.3 mg/L、枯草芽孢杆菌 0.55 亿/mL、地衣芽孢杆菌 0.21 亿/mL、巨大芽孢杆菌 0.04 亿/mL、总氮 1.12%、磷(P2O5)1.42%、钾(K2O)0.76%、砷(As)1.57 mg/kg、镉(Cd)0.18 mg/kg、铅(Pb)1.18 mg/kg、铬(Cr)0.99 mg/kg、汞(Hg)0.01 mg/kg等。

1.2 实验动物与分组选取120日龄体质量相近且健康状况良好的安义瓦灰鸡320只(全部为母鸡)，随机均分为4个处理，每个处理8个重复，每个重复10只鸡。试验采用单因素完全随机试验设计，对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别在基础饲粮中添加蚯蚓发酵液的试验饲粮，按蚯蚓发酵液/饲粮分别为2.5，5.0，7.5 μL/g的质量浓度添加蚯蚓发酵液。基础饲粮为玉米—豆粕型，参照《中国饲料成分及营养价值表(2019年第30版)》和《鸡饲养标准》(NY/T 33-2004)进行配制，其组成及营养水平见表1。试验期42 d。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) %

1.3 饲养管理试验开始前，对鸡舍及其用具进行彻底清扫和消毒。饲养试验于江西农业大学动物基地完成，试验期间，试验鸡采用舍内阶梯笼养，自由采食与饮水，饲养环境与管理条件一致，鸡舍通风和环境符合卫生要求，各组鸡饲养管理和免疫接种程序按常规饲养规程进行。

1.4 测定指标及方法

1.4.1生长性能的测定 试验期间，每天以重复为单位，记录各组安义瓦灰鸡的日采食量，0，14，28，42 d，空腹称质量，计算其平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)及料重比(F/G)。

1.4.2血样采集及指标测定 在试验42 d分别从每个重复中随机选择6只安义瓦灰鸡，每组48只，共192只，进行空腹12 h，翅静脉采血5 mL，室温静置1 h，3 000 r/min离心10 min，吸取血清(上清液)分装于200 μL EP管中，-20℃保存。

血清抗氧化指标：丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)均采用试剂盒检测，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

血清生化指标：总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、碱性磷酸酶(AKP)、脂肪酶(LPS)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、钙(Ca)均采用试剂盒检测，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

血清生理指标：采用全自动血液细胞分析仪(迈瑞 BC-2800,深圳)测定血清中白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞分布宽度变异系数(RDW)、血小板数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、血小板压积(PCT)。

激素指标：采用全自动电化学发光免疫仪(罗氏E 801，德国)测定血清中雌二醇(E2)、三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)含量。

1.4.3免疫器官指数 饲养试验结束后，每组每个重复随机选取6只接近平均体质量的安义瓦灰鸡，屠宰，摘取胸腺、法氏囊、脾脏，称量质量并计算免疫器官指数。

免疫器官指数(%)=[免疫器官质量(g)/活体质量(g)]×100%。

1.4.4油红O染色观察肝组织脂肪沉积 将屠宰后的鸡，剖开腹腔，剪开胸骨，取出完整的肝脏，用生理盐水冲洗后，在每只鸡肝脏的肝小叶边缘位置切除相同大小的肝脏组织，于-80℃冻存，由武汉市皮诺飞生物科技有限公司制作冰冻切片并进行油红O染色，镜下观察脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，红色面积越大代表脂肪沉积越严重。

2 结果

2.1 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡生长性能的影响由表2可知，试验Ⅱ、Ⅲ组的料重比显著低于对照组(P<0.05)。其他指标无显著差异(P>0.05)。

表2 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡生长性能的影响

2.2 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清抗氧化指标的影响由表3可知，与对照组相比，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组MDA含量分别降低25.98%，30.43%和23.43%(P<0.05)；SOD活性分别升高25.52%，34.51%和26.60%(P<0.05)；GSH-Px活性分别升高21.17%，26.05%和31.40%(P<0.05)；CAT活性分别升高56.42%，76.61%和41.28%(P<0.05)。

表3 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清抗氧化指标的影响

2.3 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清生化指标的影响由表4可知，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组TP含量较对照组分别升高了8.58%，14.26%和13.42%(P<0.05)。试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组ALB含量较对照组分别升高了16.13%，27.48%(P<0.05)和12.78%(P>0.05)。试验Ⅲ组与对照组相比，显著降低总胆固醇(T-CHO)的含量(P<0.05)。此外，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清中AKP的活力显著高于对照组(P<0.05)，分别较对照组升高了26.62%，34.78%和28.43%(P<0.05)。

表4 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清生化指标的影响

2.4 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清生理指标的影响由表5可知，与对照组相比，试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组对血清生理指标的影响不显著(P>0.05)。

表5 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清生理指标的影响

2.5 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清激素指标的影响由表6可知，与对照组相比，试验Ⅱ、Ⅲ组血清中T3、T3/T4的浓度显著升高(P<0.05)，其他激素指标无显著性影响(P>0.05)。

表6 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清激素指标的影响

2.6 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡免疫器官指数的影响由表7可知，与对照组相比，试验Ⅲ组的法氏囊指数显著提高(P<0.05)，较对照组提高了32.5%。

表7 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡免疫器官指数的影响

2.7 油红O染色的肝脏切片观察油红O染色见图1，结果显示，对照组鸡肝细胞内可见部分散在的红色脂滴，呈弥漫状(图1A)；细胞核被染成蓝色，散布有少数细小脂滴，脂肪变性程度和脂滴含量均较对照组有明显改善(图1B、C)；细胞浆可见少数红色脂滴(图1D)。

A..对照组；B～D.分别对应3个试验组

3 讨论

3.1 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡生长性能的影响生长性能是品种鉴定，评价饲养管理状况、营养状况和经济效益的重要参考指标[14]。料重比是表示饲料转化率的重要指标，料重比越低则相应的饲料转换率越高[15]。本试验结果显示，添加蚯蚓发酵液的质量浓度在5 μL/g以下时，可显著降低安义瓦灰鸡的料重比。与雷小文等[16]、李娟等[17]的研究结果相近。原因可能是：蚯蚓发酵液中含有枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌，这两种益生菌能够提高动物的消化率以及生长性能[18]。其机理可能是益生菌将蛋白质降解为小肽，将多糖降解为易吸收的短链糖类或单糖，从而提高动物的饲料利用率，加快生长速度[19]。同时枯草芽孢杆菌可以产生高活性的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，从而降解植物中的复杂碳水化合物，提高营养物质的消化率，并为动物提供更多的营养，使得饲料原料原有的营养结构被改变，营养性提高，更容易在消化道中吸收利用[20]；蚯蚓中的蚓激酶、抗菌肽等改善了消化道内环境、促进了饲料的消化功能，同时蚯蚓在发酵过程中，会降解自身的部分毒素和抗营养因子[21]，产生多种不饱和脂肪酸和芳香酸，微生物菌体蛋白和有益代谢产物等，改善营养物质的消化吸收，促进动物机体生长。

3.2 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清抗氧化指标的影响动物机体在新陈代谢过程中会产生大量的自由基，当过多的自由基不能被有效清理时，其过氧化作用会对动物产生不利或有害作用[22]。SOD、GSH-Px、CAT是机体中主要的抗氧化物酶，维持着机体的氧化平衡，它们能清除多余的超氧阴离子自由基，保护细胞免受氧化损伤[23]，而MDA含量则反映脂质过氧化程度，间接反映细胞受损伤程度[24]。SOD能够促使体内过量的自由基产生歧化，减少自由基过量对细胞膜产生的损害从而提高动物的抗衰老和免疫能力[25]。GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶，它能催化还原型谷胱甘肽(GSH)变为氧化性谷胱甘肽(GSSG)，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受损害[26-27]。CAT可清除H2O2自由基，避免细胞和组织受到氧化损伤[28]。MDA为脂质氧化反应的稳定终产物，其含量越高反映了自由基对机体脂肪的损伤程度越大，表明机体细胞膜和肝组织被氧化受损[29]。徐麒麟等[30]研究结果表明，蚯蚓提取物的添加可提高成华猪机体的抗氧化功能。

本试验结果显示，蚯蚓发酵液的添加能显著提高安义瓦灰鸡血清中SOD、GSH-Px及CAT活性，降低MDA的含量。这表明在饲粮中添加蚯蚓发酵液可以提高细胞的抗氧化功能，降低细胞受脂质过氧化造成的损伤。原因可能是：蚯蚓发酵液中的精氨酸能有效地提高机体总抗氧化能力，降低体内自由基含量，抑制活性氧(ROS)生成与积累，促进GSH合成与积累，增强内源性抗氧化酶(CAT、SOD等)活性，抑制氧化应激的产生[31]；试验组抗氧化能力的增强也可能与蚯蚓发酵液中的益生菌有关，益生菌可以通过其金属离子螯合能力，抗氧化系统，调节信号通路，酶产生ROS簇等方面发挥其抗氧化作用[32]；蚯蚓发酵液中的维生素A可能通过IL-1和核因子E2相关因子2(Nrf2)/GPx1/核转录因子-κB(NF-κB)途径对一氧化氮(NO)的过量生成进行调节，进而减缓动物细胞的氧化应激，提高机体的抗氧化能力[33]。

3.3 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清生化生理指标的影响动物机体的原料以及消化产物的代谢都是通过血液的运输来实现，血清生化指标的变化能够直接反映动物的营养状态和健康状况，也能反映组织器官机能的变化[34]。血清TP和ALB的含量主要受饲粮类型以及营养水平的影响，可以反映机体的蛋白质代谢水平和免疫机能[35]。T-CHO不仅是构成动物机体的重要组织成分，也是血液中的脂类转移系统的必需因子，其含量的高低能够体现出动物机体内脂肪的沉积状况，当机体脂肪沉积增加时，其含量降低[36]。血清中AKP主要来自肝脏和骨骼，国内外研究一致认为AKP是反映骨改变全过程最合适的指标，其特异性、灵敏度及准确性优于其他物质[37]，其活性对动物机体骨骼的发育和钙(Ca)、磷(P)代谢有重要的影响作用[38]，并能反映机体肝脏功能受损程度和抗应激能力[39]。本试验结果表明，蚯蚓发酵液的添加可以增加血清中蛋白含量，降低胆固醇含量，提高AKP的含量。表明蚯蚓发酵液的添加能增强机体的蛋白质合成代谢和免疫力，促进机体内的脂肪沉积。原因可能是由于蚯蚓发酵液的添加会促进肝脏细胞活力，进而加快脂肪消化吸收和钙磷沉积，提高机体的抗应激能力，从而改善鸡的免疫力。

3.4 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡血清激素指标的影响甲状腺激素通过信号的级联反应调节物质代谢，能够直接地反映机体的基础代谢率，具有促进机体新陈代谢及组织生长发育的作用，包括T3和T4[40-41]。T3、T4具有较广泛的生理作用，可通过作用于线粒体促进细胞氧化作用，使糖、脂肪的氧化作用加强，可为体内蛋白质合成提供足够的ATP，促进蛋白质和各种酶的生成，使机体在不同营养条件下维持总氮平衡[42]。T3的活性是T4的数倍，T3一部分由甲状腺直接分泌，另一部分由T4在组织内脱碘酶的作用下转变为T3，并且在局部发挥生理作用[43]。血液中甲状腺激素主要以T4形式存在，由甲状腺合成并释放到血液中[44]。T3/T4值的大小反映出T4向T3转化的能力，较高的T3/T4值代表具有较高的甲状腺功能活性[45]。本试验结果显示，与对照组相比，试验Ⅱ、Ⅲ组蚯蚓发酵液的添加量显著提高T3和T3/T4的值，这表明蚯蚓发酵液有利于提高安义瓦灰鸡甲状腺功能的活性，并能通过提高T3的分泌促进鸡体内脂类的氧化分解。

3.5 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡免疫器官指数的影响免疫器官是免疫细胞发育、增殖和分化的场所，免疫器官的发育情况以及功能的强弱对禽类的免疫水平起着至关重要的作用[46]。胸腺、脾脏及法氏囊是禽类最重要的免疫器官，免疫器官称重法是研究机体免疫状况的方法之一[47]。一般研究认为，免疫器官质量降低为免疫抑制所致，免疫器官质量增加则为免疫增强的表现[48]。而法氏囊是禽类特有的体液免疫器官，法氏囊指数增大表明机体的免疫机能提高[49]。刘瀚扬等[50]研究表明，蚯蚓提取物在一定添加范围内能促进小鼠免疫器官的发育。本试验结果显示，添加适量的蚯蚓发酵液能显著提高鸡的法氏囊指数，表明蚯蚓发酵液对鸡免疫器官的发育具有促进作用，进而增加机体的免疫功能。

3.6 蚯蚓发酵液对安义瓦灰鸡肝脏的影响肝脏脂滴是肝细胞内的一种特殊细胞器，可特异性储存中性脂肪，如胆固醇酯和甘油三酯，直接参与肝脏脂类代谢[51]。脂滴形成后可通过两条途径增大，在已有脂滴基础上不断扩大或者合成新脂滴不断融合形成大脂滴[52]。脂滴水解主要途径为：甘油三酯脂肪酶催化甘油三酯水解，羧酸酯酶3和CIDEB介导的脂解[53]。通过油红O染色的结果来看，蚯蚓发酵液的添加降低了脂滴在肝脏的沉积，从这一结果可推断出，蚯蚓发酵液可以使脂肪转运能力升高，加强脂滴的水解，最终起到降低肝脏脂滴含量的效果。

综上所述，在饲粮中添加适量的蚯蚓发酵液可以调节安义瓦灰鸡的生长性能、血清抗氧化能力和免疫能力，降低血脂水平，提高甲状腺功能的活性，促进免疫器官发育，改善肝脏的脂肪沉积，以5 μL/g蚯蚓发酵液添加量的效果最佳。