便携式多信号传感平台检测抗坏血酸

高 荣， 罗大娟， 苏丽霞， 苏永欢， 张 梅，刘冰倩*

(贵州大学药学院，贵州省合成药物工程实验室，贵州贵阳 550025)

抗坏血酸(AA)是一种己糖醛基酸，其作为抗氧化剂和自由基清除剂，能够缓和多种疾病的氧化应激[1,2]，如保护细胞、延长寿命、防治动脉硬化、有促进伤口的愈合、提高人体的免疫力，同时具有抗癌作用等，是一种与生命活动密切相关的化合物。当血液中AA的浓度低于10 mmol/L时，可引起坏血病，造成机体血管系统紊乱、皮下及肌肉组织出血、皮肤淤点、甚至引起各种心血管疾病等[3]。因此，研究开发对AA快速准确的分析方法是很有必要的。

目前，检测AA的方法很多，如：高效液相色谱法(HPLC)[4]和紫外-可见(UV-Vis)分光光度法[5]，而荧光分析法和电化学生物传感器[6]是基于多学科相互渗透发展起来的高新技术，能在复杂体系中进行连续监测。虽然这些方法能够满AA检测的要求，但通常受仪器昂贵和涉及高度复杂程序的限制，难以普及；碘量法和比色分析法操作简单，但滴定终点需通过肉眼辨别，且某些样品本身存在颜色干扰，有一定的局限性[7]。近年来，便携式传感器被大量开发，如Zhu等人[8]开发了以气压信号为输出终端的便携式传感器，使用辣根过氧化氢物酶(HRP)对检测抗体功能化与靶抗原形成夹心式复合物，然后催化底物H2O2分解，导致反应室内的气压显著增加进而实现对目标物检测。便携式传感器通常将目标物信号转化为压力、温度、pH和重量等易被捕获的信号为检测终端，可以实现对目标物的快速、实时、低成本地检测。

信号输出模式多种多样，单信号检测是基于某个单一信号输出实现对目标物检测，如Liu等人[9]提出了以温度计为检测手段对纳米金晶体生长的光热免疫分析。同样Fu等人[10]首次发现了纳米氧化铁介导的TMB-H2O2比色体系，通过近红外激光驱动的光热效应将免疫分析转化为热信号，使利用温度计进行简单的光热免疫分析成为可能，在生物医学方面具有巨大的应用潜力。单信号检测大多存在着信号单一、准确度不够等方面的局限性，而Chen等人[11]创新性地建立了由光热触发的多信号检测系统(MSR)，在近红外激光的激发下，利用光热转换效应使多信号传感元件的热能急剧增加，结果引起局部温度升高、视觉颜色变化以及体重下降等信号。值得一提的是，其中多种信号相互佐证、相互补充有望产生更可靠的结果且极大地降低成本、实现高灵敏度的即时检测(POCT)。本研究利用AA的还原性质，以CoOOH纳米片对H2O2分解为平台，基于气压、温度和质量为一体的多信号传感平台实现对AA定量检测，并应用于实际样品分析。实验原理图见图1。与其它对AA的传感平台相比较，本方案采用便携式气压计、笔试温度计和电子天平作为信号获取工具，具有易于富集、低廉、便捷等特点，有望实现AA筛选的普及化检测仪，利于进行药品、食品大量样本的初步筛选。

图1 实验原理图Fig.1 Schematic diagram showing the detection principle

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HT-930专业差压测量仪(广州宏诚集业电子科技有限公司)；T-105探针式电子温度计(西安温美测实业有限公司)；BSA224S电子天平(上海赛利多斯科学仪器有限公司)。

抗坏血酸(AA,纯度≥99.7%，上海试四赫维化工有限公司)；H2O2、NaCl(天津市永大化学试剂有限公司)；CoCl2·6H2O、HCl、NaOH(天津市科密欧化学试剂有限公司)；柠檬酸、柠檬酸钠(天津市优谱化学试剂有限公司)；谷氨酸、组氨酸(上海源叶生物科技有限公司)；其它试剂均为国产分析纯，实验用水为去离子水。

维C银翘片(贵州百灵集团制药股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 CoOOH纳米片的合成CoOOH纳米片是根据之前的报道方法[12]制备，只做了少量的修改。其合成过程如下：将0.1903 g CoCl2·6H2O溶解在80 mL去离子水中，在剧烈搅拌下加入20 mL NaOH溶液(1.0 mol/L)，超声溶解1 min后，与4 mL NaClO(0.9 mol/L)溶液混合并超声20 min，用去离子水洗涤3次并离心10 min(8 000 r/min)，最后将褐黑色的CoOOH纳米片重新分散于9 mL去离子水中(5.44 mg/mL)，并在4 ℃下保存，备用。

1.2.2 多信号传感平台检测AA取100 μL已制备的CoOOH纳米片于密闭反应瓶中，分别加入100 μL不同浓度的AA溶液，室温孵育5 min后，加入50 μL Tris-HCl缓冲液(pH=10)和100 μL 6%H2O2溶液，迅速将反应体系用胶塞密封，利用气压计检测反应瓶中每1 min的气压变化，并用温度计检测每20 s反应瓶中温度的变化。气压的增加迫使一定量的水从排水瓶溢出到预先装有NaOH溶液的集水瓶中，通过电子天平准确称量溢出水的重量变化，由于NaOH良好的溶解放热效应，再次利用温度计检测每10 s集水瓶中温度的变化。

1.2.3 实际样品的检测本实验对维C银翘片实际样品中AA进行了考察[13]。取本品两片，精密称定，充分研磨至细，精密称取0.567 g(每片含有维生素C为49.5 mg)，充分振摇使其溶解，然后在冷冻离心机中离心10 min(1 200 r/min)，使用0.45 μm孔径滤膜对过滤，上清液用去离子水分别稀释为50、100、200、400 μg/mL，进行加标回收率考察。

2 结果与讨论

2.1 CoOOH纳米片表征

CoOOH纳米片成功合成直接影响实验结果，因此我们首先利用紫外-可见吸收光谱对CoOOH纳米片进行表征。如图2A中可见，CoCl2在波长521 nm有明显的特征吸收峰，而形成CoOOH纳米片后，分别在234 nm和380 nm处出现两处新的吸收峰，与已报道[14]的结果一致。如图2B所示，通过X射线衍射显示出两个典型的结晶峰，分别对应的2θ为20.0°和39.2°处的(003)和(012)。通过与标准JCPDS卡(编号07-0169)的比较，进一步证明了结晶CoOOH纳米片的制备是成功的。最后用扫描电子显微镜对制备的CoOOH纳米片进行了形貌表征，由图2C和2D中可以明显的看到CoOOH纳米片是一种正六边形薄片，平均厚度为7.5 nm，平均尺寸为120 nm，且具有良好的单分散性[15]。这些结果证实了CoOOH纳米片的合成成功。

图2 (A)CoCl和CoOOH纳米片的紫外-可见吸收光谱图；(B)CoOOH纳米片的X射线衍射图谱；(C、D)CoOOH纳米片的扫描电镜图像Fig.2 (A) UV-Vis absorption spectra of CoCl and CoOOH nanoflakes;(B) X-ray diffraction patterns of CoOOH nanoflakes;(C) and (D) are scanning electron microscopic images of CoOOH nanoflakes respectively

2.2 CoOOH纳米片对AA响应表征

从图3A中可知，CoOOH纳米片被AA还原之后，可以明显的观察到CoOOH纳米片在234 nm和380 nm两处的吸收峰明显减弱。同样通过循环伏安法(图3B)，当CoOOH纳米片被400 μg/mL AA还原后，观察到峰电流明显下降，表明CoOOH与AA的相互作用后明显阻滞了电荷转移效应，这与典型的电化学阻抗谱的结果有很好的一致性。在交流阻抗谱图中，较高频率的半圆形部分通常对应于电荷转移受限过程，随着界面电荷转移电阻的增大，半圆形的直径明显增大[16,17]。如图3C所示，CoOOH纳米片被400 μg/mL AA反应之后，电极的阻抗谱半圆形区域显著增加(Rct=49 Ω)，说明电极表面的电荷转移封闭作用明显增强。以上结果进一步证实了CoOOH纳米片与AA之间产生了相互作用。

图3 (A)AA、CoOOH纳米片以及孵育之后的紫外-可见吸收光谱图；(B)不同材料修饰电极的循环伏安图；(C)CoOOH与0.4 mg /mL AA孵育前后的交流阻抗谱Fig.3 (A) UV-Vis absorption spectra of AA,CoOOH nanoflakes and after the reaction between them;(B) Cyclic voltammograms of different modified electrodes;(C) Electrochemical impedance spectroscopy characterization of CoOOH before and after incubation with 0.4 mg/mL AA

2.3 实验可行性分析

如图4A、4B所示，随着AA浓度的增加，在10 min内密闭反应瓶中的气压和温度变化都显著降低，当AA为400 μg/mL时，气压的变化量(ΔP)仅增加3.66 kPa，温度变化(ΔT1)为0.5 ℃。同样的，这种气压的降低导致在集水瓶中收集到水的量也进一步减少，如图4C，排水瓶中溢出水的重量与AA的浓度呈现正相关，当AA由50 μg/mL增加400 μg/mL时，水增重幅度(ΔW)从1.60 g减少到0.68 g。在图4D中，在集水瓶中预装的NaOH吸水溶解并放出热量，当AA由50 μg/mL增加到400 μg/mL时，升温幅度(ΔT2)从8.1 ℃减小到5.8 ℃。这些结果表明，我们开发的综合了压力、温度和质量信号的传感系统可成功的用于AA检测。

图4 (A)ΔP和(B)ΔT1信号对AA的响应变化；(C)ΔW和(D)ΔT2信号对AA的响应变化Fig.4 (A) ΔP and (B) ΔT1 variations in response to AA;(C) ΔW and(D) ΔT2 variations in response to AA

2.4 实验条件优化

2.4.1 CoOOH纳米片和AA孵育时间图5A为AA与CoOOH纳米片孵育不同时间所对应ΔP，在孵育时间5 min之内，气压呈明显的减小趋势，在5 min之后，气压变化并不明显，趋于平稳。因此在整个实验过程中选择孵育时间为5 min。

图5 AA与CoOOH纳米片的反应时间(A)、不同种类缓冲溶液(B)及缓冲溶液的不同pH值(C)对ΔP的影响Fig.5 Effect of reaction time between AA and COOOH nanosheets (A),of different buffer solutions (B) and of different pH values of buffer solution (C) on ΔP

2.4.2 缓冲溶液的选择如图5B所示，考察不同缓冲溶液中所对应的气压响应信号。选择Na2HPO4-柠檬酸、KH2PO4-NaOH、Na2HPO-NaH2PO4缓冲体系时，ΔP变化并不明显(ΔP<2 kPa)；而缓冲溶液为KCl、柠檬酸-NaOH、Tris-HCl时,ΔP变化较为明显(ΔP>7 kPa)。其中，在Tris-HCl缓冲溶液中ΔP变化最为明显，因此选择Tris-HCl缓冲溶液。

2.4.3 缓冲溶液pH值缓冲溶液的pH值也是影响CoOOH纳米片催化H2O2分解的关键因素之一。在图5C中可以看到，Tris-HCl缓冲溶液的pH<10时，ΔP呈增大趋势，当Tris-HCl缓冲溶液的pH>10时，ΔP呈减小趋势。因此选择Tris-HCl缓冲溶液的pH为10。

2.5 基于多信号传感平台对AA的分析性能

在最优的条件下，利用多信号传感检测平台检测AA的气压响应信号。如图6A所示，AA质量浓度在12.5～400 μg/mL范围内，ΔP信号与AA浓度对数呈良好的线性关系，线性方程为：ΔP=-0.87 IncAA+8.69，线性相关系数R2=0.9930。随后，利用多信号传感平台检测不同浓度AA对CoOOH催化H2O2体系温度变化的影响，如图6B所示，ΔT1响应信号与目标物AA呈现良好的正相关，线性方程为：ΔT1=-0.66lncAA+4.28，线性相关系数R2=0.9800。

图6 ΔP(A)和ΔT1(B)检测AA的校准曲线Fig.6 Calibration curves of ΔP used to detect AA (A) and calibration curves of ΔT1 used to detect AA (B)

在最优条件下，利用多信号传感检测平台对AA的质量响应信号。如图7A所示，AA在12.5～400 μg/mL范围内，随着目标物AA浓度的增大，溢出水的质量逐渐减小，质量信号与AA浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程为：ΔW=-0.11lncAA+1.33，线性相关系数R2=0.9940。同时，对基于NaOH溶解放热的温度传感信号进行了研究，如图7B所示，ΔT2响应信号与AA浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程为：ΔT2=-1.28lncAA+13.46，线性相关系数R2=0.9950。

图7 ΔW(A)和ΔT2(B)检测AA校准曲线Fig.7 Calibration curves of ΔW (A) and ΔT2 (B) used to detect AA

2.6 多信号传感平台的选择性和稳定性考察

考察了该传感平台对与AA的选择性，干扰物质包括金属离子(Na+、K+、Ca2+)、阴离子(Cl-)、谷氨酸(Glu)、组氨酸(His)、生物小分子物质(C6H12O6、NaClO和C6H5Na3O7)。如图8A所示，只有在AA存在的情况下，可导致ΔP信号明显下降，在相同条件下，10倍浓度的上述物质未引起信号的明显下降。因此多信号传感平台对AA的检测具有良好的特异性和抗干扰性。

为考察平台的稳定性，在相同的条件下检测7 d内ΔP变化趋势。在图8B中明显的看到在7 d内，平台的气压变化值较稳定，相对标准偏差(RSD)值为2.42%，进一步说明我们所构建的多信号检测平台在分析AA具有良好的稳定性。

图8 (A)特异性实验结果(AA的浓度为25 ng/mL，其它干扰物质的浓度为250 ng/mL)；(B)检测平台在7天内的稳定性测试结果Fig.8 (A) The specificity test results (the concentration of AA was 25 ng/mL and the concentration of other interfering substances was 250 ng/mL);(B) Stability test results of the test platform within 7 days

2.7 实际样品测定

利用该传感平台对维C银翘片实际样品中AA进行检测，进一步探究该方法的实用性并证明结果的可靠性，利用气压响应信号分析，进行加标回收实验，获得的回收率为85.4%～116.7%(表1)，RSD为0.3%～2.1%，表明本研究建立的基于多信号传感检测平台检测AA的方法可用于维C银翘片的定量检测。

表1 实际样品中AA的测定

3 结论

利用AA对CoOOH纳米片还原使其失去催化性质机理，以CoOOH纳米片对H2O2的分解从而引起气压、温度和质量多种信号的变化为检测平台，建立基于普通的手持式数字压力表、智能数字温度计和电子天平检测AA的新方法。本方法操作简单，便携性好，经济且快速，可用于维C银翘片中AA的检测。本研究不仅综合了气压、温度和重量为一体检测AA的新方法，也为便携式AA检测仪的开发提供了新思路。