高荧光氮掺杂碳点用于卡马西平和琥乙红霉素的测定

孙雪花， 强 瑜， 田 锐， 张锦婷， 高楼军

(陕西省化学反应工程重点实验室，延安大学化学与化工学院，陕西延安 716000)

卡马西平(Carbamazepine，CAMP)主治癫痫病，也可用于惊厥、狂躁、神经性疼痛等的治疗，但在临床中浓度过低治疗无效，浓度过高则有毒副作用。目前卡马西平的检测，多用毛细管电泳[1]、反相液相色谱[2]、免疫法[3]、拉曼光谱法[4]等。琥乙红霉素(Erythromycin Ethylsuccinate，EMES)属于大环内酯类抗生素，是青霉素过敏患者治疗时的替代用药，临床上出现不良反应的几率低，毒性小，抗菌谱广，疗效确切。近年来对其检测的方法有：高效液相色谱法[5]、近红外光谱法[6]、荷移分光光度法[7]、电化学法[8]。然而，这两种药物的检测方法有的过程繁琐，有的成本较高。荧光分析法因其简单、快速、灵敏度高等特点已被广泛应用。碳点(Carbon Dots，CDs)作为一种新型的以碳为骨架结构的荧光纳米材料，因其毒性低、生物安全性强、化学稳定性高、无光眨眼和光漂白现象的优点而备受关注。目前，已广泛用于环境监测[9]、生物成像[10,11]以及光电器件[12]等诸多领域。

本文通过色氨酸对CDs表面进行氮掺杂，大大提高了氮掺杂碳点(NCDs)的荧光量子产率。同时研究发现药物CAMP和EMES对NCDs的荧光具有一定的猝灭作用，以此建立了检测CAMP和EMES的荧光分析新方法。方法用于实际药物的检测，结果较好。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

LS-55荧光分光光度计(美国，PE公司)；UV-2550型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；IR Prestige-21傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪(日本，岛津公司)；ESCALAB 250XI型X射线光电子能谱(XPS)仪(美国，赛默飞世尔科技公司)；XRD-7000 X粉末衍射(XRD)仪(日本，岛津公司)；Tecnai G2 F20 S -Twin型高分辨透射电子显微镜(HRTEM)(美国，FEI公司)。

EMES标准溶液(0.002 mol/L)：准确称取100 mg EMES标准品(上海哈灵生物科技有限公司)，加入适量无水乙醇超声溶解，并用无水乙醇定容于50 mL容量瓶中，用时逐级稀释。CAMP标准溶液(0.006 mol/L)：准确称取CAMP标准品(上海哈灵生物科技有限公司)0.1404 g，加入适量无水乙醇超声溶解，并用无水乙醇定容于50 mL容量瓶中，用时逐级稀释。

KH2PO4-NaOH缓冲溶液(pH=6.0)、D-麦芽糖(成都市科龙化工试剂厂)、L-色氨酸(上海蓝季生物)。所有试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

琥乙红霉素片1(批号：1611483-1，规格：0.125 g，西安利君制药有限责任公司)，琥乙红霉素片2(批号：1612483-1，规格：0.125 g，西安利君制药有限责任公司)。卡马西平片(批号：X1091，规格：200 mg，北京诺华制药有限公司)。

1.2 NCDs的制备

取3.0 g D-麦芽糖与1.5 g色氨酸，置于50 mL烧杯中，加超纯水至25 mL，超声搅拌溶解，将该溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，在200 ℃下反应2 h，得到深褐色的NCDs粗溶液。待NCDs溶液冷却至室温后，将其在10 000 r/min的转速下离心10 min，除去大颗粒杂质，再用微孔滤膜(0.22 μm)过滤，即得NCDs原液。

1.3 NCDs荧光量子产率的测量

取溶于0.050 mol/L的稀H2SO4的硫酸奎宁(Quinine Sulphate，QS)溶液，通过测量QS溶液和NCDs稀溶液在同一激发波长365 nm下的积分荧光强度和对该波长激发光的吸光度(吸光度相近且均不大于0.05)，文献报道方法[13]计算NCDs荧光量子产率为30.42%。

1.4 CAMP和EMES荧光探针的建立

于10 mL比色管中，加入稀释104倍的NCDs溶液1.50 mL，K2HPO4-NaOH缓冲溶液(pH=6.0)在测定CAMP时加入1.00 mL，测定EMES时加入0.50 mL，再加入适量CAMP标准溶液或者EMES标准溶液，用超纯水稀释至刻度，摇匀。在室温下静置10 min后，于λex=365 nm，λem=440 nm处测定体系荧光强度F和空白试剂的荧光强度F0。体系荧光猝灭强度ΔF=F0-F与药物CAMP和EMES之间存在线性关系。

2 结果与讨论

2.1 NCDs的形貌与结构分析

2.1.1 透射电镜和X射线衍射图1A为NCDs的透射电子显微镜(TEM)的照片，可以看出NCDs呈球形颗粒，分散性良好，无团聚现象。图1A中的插图显示NCDs晶格间距为0.32 nm，对应于石墨碳的(002)晶面，说明所得NCDs具有石墨碳的结构[13]。由图1B看出NCDs的平均粒径约为3.0 nm，尺寸较小。图1C X射线衍射(XRD)显示，NCDs在2θ=22.4°处出现了一个宽的衍射峰，晶面间距较大，可归属为石墨碳的(002)晶面[14]，与TEM图一致。相比于CDs，衍射峰位置偏差不大，但晶格间距明显增大，说明掺杂后的CDs颗粒粒径较小，这可能是由于含氧和含氮基团的存在导致了晶格间距的增大。

图1 NCDs的透射电镜(TEM)和X射线衍射(XRD)图Fig.1 The TEM and XRD diagram of the NCDs

2.1.2 X射线光电子能谱采用X射线光电子能谱(XPS)对NCDs的元素及其官能团进行分析，从图2A发现，有对应C、N和O元素的特征峰283 eV、399 eV、530 eV出现。图2B中显示283.93 eV、287.73 eV、291.58 eV谱峰应为C 1s的C=O、C=C特征峰；图2C的530.78 eV谱峰是O 1s的C=O[15]；图2D的399.43 eV谱峰是N 1s光谱的C-N。证明NCDs表面存在大量含O和含N官能团。

图2 NCDs的XPS总谱(A)及高分辨C1s谱(B)、O1s谱(C)和N1s谱(D)Fig.2 (A)The full scan XPS of NCDs.high resolution XPS of C 1s(B),O1s(C) and N1s(D)

2.1.3 红外光谱、荧光光谱和紫外光谱NCDs的红外光谱图3A显示，在3 421 cm-1处对应为O-H和N-H的伸缩振动峰，2 933 cm-1可能为亚甲基的C-H的反对称伸缩振动吸收峰，1 654 cm-1是强烈的C=O伸缩振动和N-H的弯曲振动吸收峰，1 045 cm-1为C-O的振动伸缩，此外1 458 cm-1为C-H的弯曲振动和C-N伸缩振动吸收峰，说明CDs已成功实现氮掺杂。NCDs表面富含氨基、羟基和羧基，这些亲水基团使得NCDs具有很好的水溶性。这与XPS推断一致。图3B是NCDs在不同激发波长下的荧光发射光谱，可看出NCDs的发射峰并未随激发波长的变化而改变，说明此NCDs不具有激发依赖性。

图3 (A)NCDs的FTIR光谱图，(B)不同激发下的NCDs的荧光光谱图Fig.3 FTIR spectrum of the NCDs (A) and fluorescence spectra of the NCDs under different excitations(B)

2.2 测定CAMP和EMES的NCDs荧光探针的构建

图4A是NCDs在365 nm处激发时不同体系的荧光光谱。体系中药物CAMP和EMES本身无荧光，无背景影响，但二者都会不同程度的对NCDs的荧光强度产生猝灭现象(图4A中曲线c、曲线b)。可能是药物分子与NCDs表面的-COOH、-OH、-NH等基团之间发生电子转移所致。通过紫外吸收光谱图4B、4C分析，发现NCDs在218 nm处有强吸收，而278 nm处有中等强度的吸收带，推断是芳香碳核心C=C键的π-π*跃迁，说明NCDs具有碳碳共轭结构。而药物EMES在紫外区仅有弱的吸收(图4B曲线b)，CAMP在210 nm和286 nm处有两个吸收峰(图4C曲线b)，当药物EMES和CAMP加入体系作用后，发现NCDs的吸收峰位置并没有发生改变，而只是218 nm和278 nm处的吸光度有所增加(图4B曲线c、图4C曲线c)，恰为药物分子和NCDs二者的吸光强度之和，由此说明药物分子EMES和CAMP影响了NCDs的激发态，产生了动态猝灭作用[16]。再依据Stern-Volmer方程[17]：F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]，式中KSV为猝灭常数，Kq是由扩散过程控制的双分子猝灭速率常数，[Q]是猝灭剂的浓度，τ0为荧光分子平均寿命。通过改变温度，绘制了EMES和CAMP猝灭NCDs的F0/F～[Q]线性曲线，发现KSV随温度升高逐渐增大，推断药物分子EMES和CAMP对NCDs的猝灭机理是动态猝灭。以此构建测定CAMP和EMES的NCDs荧光探针是可行的。

图4 体系的荧光光谱(A)和紫外光谱(B，C)Fig.4 Fluorescence spectra(A) and UV Spectra(B,C) of the system

2.3 测定条件的优化

2.3.1 pH的影响不同pH值的缓冲溶液对体系荧光强度的影响如图5。结果表明，药物对体系NCDs的猝灭能力在强酸和强碱性条件下较差，在弱酸性pH=5.80～6.40范围内荧光猝灭程度较强。实验探讨了pH=6.00的柠檬酸-Na2HPO4、KH2PO4-NaOH、NaAc-HAc、NaH2PO4-Na2HPO4等缓冲溶液对体系的荧光强度的影响。结果药物EMES和CAMP均在pH=6.00的KH2PO4-NaOH缓冲溶液体系中对NCDs有强的荧光猝灭作用。但测定EMES时仅需此缓冲溶液0.50 mL，测定CAMP时则需缓冲溶液1.00 mL。

2.3.2 NCDs的浓度实验发现随着NCDs浓度的增加，体系的荧光猝灭强度不断增大，但当NCDs浓度太大时，体系荧光猝灭强度的增大趋势反而减缓，这可能是NCDs自猝灭的原因。考虑到对体系灵敏度的影响，实验选择用稀释104倍的NCDs溶液1.50 mL。

2.3.3 表面活性剂对体系的影响为确定表面活性剂对实验的影响，实验考察了溴代十六烷基吡啶、曲拉通X-100、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、乳化剂OP-10、十六烷基三甲基溴化铵等表面活性剂对实验体系的影响。结果发现上述几种表面活性剂都对实验体系均无增敏作用，因此实验确定不添加任何表面活性剂。

2.3.4 温度、反应时间及稳定性在实验最佳条件下，30 min内每隔5 min测定一次，之后每隔1 h测定一次，发现药物EMES和CAMP对NCDs的荧光猝灭作用迅速，加入时刻瞬间猝灭且至少可以稳定4 h。但发现体系的荧光猝灭强度受温度的影响，随温度的升高反而下降。因此实验选择在室温下体系反应稳定10 min后进行测定。

2.3.5 共存物质的影响在室温下，按照实验最佳条件，分别研究了浓度为2.1×10-4mol/L的EMES标准溶液，浓度为6.0×10-4mol/L的CAMP标准溶液，体系荧光强度在相对误差≤±5%范围内时，药物辅料对体系的荧光强度的干扰。结果表明，500倍的葡萄糖、糊精、淀粉、乳糖、果糖、蔗糖等均不干扰。

2.3.6 标准曲线按照实验方法，当EMES标准溶液在0.01～1.7 μg/mL范围内，CAMP标准溶液在0.01～1.1 μg/mL范围内时，分别与体系ΔF呈现良好的线性关系。药物EMES的回归方程为：ΔF1=249.65c+13.288，相关系数为R2=0.9989；CAMP的回归方程为：ΔF2=288.01c+14.137，相关系数为R2=0.9972。同时对EMES和CAMP的测定体系的空白溶液平行测定了11次，根据IUPAC规定，用3S0/S计算实验方法的检出限分别为8.0 ng/mL和5.0 ng/mL。

表1为不同检测EMES和CAMP的方法比较，本法对两种药物的检测的线性范围较其他方法较窄，但此方法是对低浓度范围内的药物进行分析测定，检出限也较低，具有一定的灵敏度。

2.4 样品测定

随机抽取EMES片1、片2和CAMP片各10片，分别研磨均匀后，各准确称取相当于一片的量，用40 mL无水乙醇溶解并超声5 min后，于100 mL的容量瓶中用超纯水定容，然后静置10 min后，过滤，按照所确定好的实验方法进行测定，并进行加标回收实验，结果见表2。EMES片1的回收率为96.67%～102.2%，EMES片2的回收率为97.78%～103.3%，CAMP片的回收率为94.74%～101.7%。

表2 EMES和CAMP的测定及其回收率(n=5)

3 结论

以D -麦芽糖为碳源、L-色氨酸为氮源，采用一步水热法合成了高荧光效率的NCDs。合成的NCDs具有尺寸小、分散均匀以及良好的水溶性等特性。在KH2PO4-NaOH缓冲介质(pH=6.00)中，基于NCDs的高荧光性能，构建了测定卡马西平和琥乙红霉素的荧光分析新方法，为碳点的发展和药物的测定都提供了一定的信息。