高荧光氮掺杂碳点用于卡马西平和琥乙红霉素的测定
2022-07-23孙雪花张锦婷高楼军
孙雪花, 强 瑜, 田 锐, 张锦婷, 高楼军
(陕西省化学反应工程重点实验室,延安大学化学与化工学院,陕西延安 716000)
卡马西平(Carbamazepine,CAMP)主治癫痫病,也可用于惊厥、狂躁、神经性疼痛等的治疗,但在临床中浓度过低治疗无效,浓度过高则有毒副作用。目前卡马西平的检测,多用毛细管电泳[1]、反相液相色谱[2]、免疫法[3]、拉曼光谱法[4]等。琥乙红霉素(Erythromycin Ethylsuccinate,EMES)属于大环内酯类抗生素,是青霉素过敏患者治疗时的替代用药,临床上出现不良反应的几率低,毒性小,抗菌谱广,疗效确切。近年来对其检测的方法有:高效液相色谱法[5]、近红外光谱法[6]、荷移分光光度法[7]、电化学法[8]。然而,这两种药物的检测方法有的过程繁琐,有的成本较高。荧光分析法因其简单、快速、灵敏度高等特点已被广泛应用。碳点(Carbon Dots,CDs)作为一种新型的以碳为骨架结构的荧光纳米材料,因其毒性低、生物安全性强、化学稳定性高、无光眨眼和光漂白现象的优点而备受关注。目前,已广泛用于环境监测[9]、生物成像[10,11]以及光电器件[12]等诸多领域。
本文通过色氨酸对CDs表面进行氮掺杂,大大提高了氮掺杂碳点(NCDs)的荧光量子产率。同时研究发现药物CAMP和EMES对NCDs的荧光具有一定的猝灭作用,以此建立了检测CAMP和EMES的荧光分析新方法。方法用于实际药物的检测,结果较好。
1 实验部分
1.1 仪器及试剂
LS-55荧光分光光度计(美国,PE公司);UV-2550型紫外-可见分光光度计(日本,岛津公司);IR Prestige-21傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪(日本,岛津公司);ESCALAB 250XI型X射线光电子能谱(XPS)仪(美国,赛默飞世尔科技公司);XRD-7000 X粉末衍射(XRD)仪(日本,岛津公司);Tecnai G2 F20 S -Twin型高分辨透射电子显微镜(HRTEM)(美国,FEI公司)。
EMES标准溶液(0.002 mol/L):准确称取100 mg EMES标准品(上海哈灵生物科技有限公司),加入适量无水乙醇超声溶解,并用无水乙醇定容于50 mL容量瓶中,用时逐级稀释。CAMP标准溶液(0.006 mol/L):准确称取CAMP标准品(上海哈灵生物科技有限公司)0.1404 g,加入适量无水乙醇超声溶解,并用无水乙醇定容于50 mL容量瓶中,用时逐级稀释。
KH2PO4-NaOH缓冲溶液(pH=6.0)、D-麦芽糖(成都市科龙化工试剂厂)、L-色氨酸(上海蓝季生物)。所有试剂均为分析纯,实验用水均为超纯水。
琥乙红霉素片1(批号:1611483-1,规格:0.125 g,西安利君制药有限责任公司),琥乙红霉素片2(批号:1612483-1,规格:0.125 g,西安利君制药有限责任公司)。卡马西平片(批号:X1091,规格:200 mg,北京诺华制药有限公司)。
1.2 NCDs的制备
取3.0 g D-麦芽糖与1.5 g色氨酸,置于50 mL烧杯中,加超纯水至25 mL,超声搅拌溶解,将该溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中,在200 ℃下反应2 h,得到深褐色的NCDs粗溶液。待NCDs溶液冷却至室温后,将其在10 000 r/min的转速下离心10 min,除去大颗粒杂质,再用微孔滤膜(0.22 μm)过滤,即得NCDs原液。
1.3 NCDs荧光量子产率的测量
取溶于0.050 mol/L的稀H2SO4的硫酸奎宁(Quinine Sulphate,QS)溶液,通过测量QS溶液和NCDs稀溶液在同一激发波长365 nm下的积分荧光强度和对该波长激发光的吸光度(吸光度相近且均不大于0.05),文献报道方法[13]计算NCDs荧光量子产率为30.42%。
1.4 CAMP和EMES荧光探针的建立
于10 mL比色管中,加入稀释104倍的NCDs溶液1.50 mL,K2HPO4-NaOH缓冲溶液(pH=6.0)在测定CAMP时加入1.00 mL,测定EMES时加入0.50 mL,再加入适量CAMP标准溶液或者EMES标准溶液,用超纯水稀释至刻度,摇匀。在室温下静置10 min后,于λex=365 nm,λem=440 nm处测定体系荧光强度F和空白试剂的荧光强度F0。体系荧光猝灭强度ΔF=F0-F与药物CAMP和EMES之间存在线性关系。
2 结果与讨论
2.1 NCDs的形貌与结构分析
2.1.1 透射电镜和X射线衍射图1A为NCDs的透射电子显微镜(TEM)的照片,可以看出NCDs呈球形颗粒,分散性良好,无团聚现象。图1A中的插图显示NCDs晶格间距为0.32 nm,对应于石墨碳的(002)晶面,说明所得NCDs具有石墨碳的结构[13]。由图1B看出NCDs的平均粒径约为3.0 nm,尺寸较小。图1C X射线衍射(XRD)显示,NCDs在2θ=22.4°处出现了一个宽的衍射峰,晶面间距较大,可归属为石墨碳的(002)晶面[14],与TEM图一致。相比于CDs,衍射峰位置偏差不大,但晶格间距明显增大,说明掺杂后的CDs颗粒粒径较小,这可能是由于含氧和含氮基团的存在导致了晶格间距的增大。
图1 NCDs的透射电镜(TEM)和X射线衍射(XRD)图Fig.1 The TEM and XRD diagram of the NCDs
2.1.2 X射线光电子能谱采用X射线光电子能谱(XPS)对NCDs的元素及其官能团进行分析,从图2A发现,有对应C、N和O元素的特征峰283 eV、399 eV、530 eV出现。图2B中显示283.93 eV、287.73 eV、291.58 eV谱峰应为C 1s的C=O、C=C特征峰;图2C的530.78 eV谱峰是O 1s的C=O[15];图2D的399.43 eV谱峰是N 1s光谱的C-N。证明NCDs表面存在大量含O和含N官能团。
图2 NCDs的XPS总谱(A)及高分辨C1s谱(B)、O1s谱(C)和N1s谱(D)Fig.2 (A)The full scan XPS of NCDs.high resolution XPS of C 1s(B),O1s(C) and N1s(D)
2.1.3 红外光谱、荧光光谱和紫外光谱NCDs的红外光谱图3A显示,在3 421 cm-1处对应为O-H和N-H的伸缩振动峰,2 933 cm-1可能为亚甲基的C-H的反对称伸缩振动吸收峰,1 654 cm-1是强烈的C=O伸缩振动和N-H的弯曲振动吸收峰,1 045 cm-1为C-O的振动伸缩,此外1 458 cm-1为C-H的弯曲振动和C-N伸缩振动吸收峰,说明CDs已成功实现氮掺杂。NCDs表面富含氨基、羟基和羧基,这些亲水基团使得NCDs具有很好的水溶性。这与XPS推断一致。图3B是NCDs在不同激发波长下的荧光发射光谱,可看出NCDs的发射峰并未随激发波长的变化而改变,说明此NCDs不具有激发依赖性。
图3 (A)NCDs的FTIR光谱图,(B)不同激发下的NCDs的荧光光谱图Fig.3 FTIR spectrum of the NCDs (A) and fluorescence spectra of the NCDs under different excitations(B)
2.2 测定CAMP和EMES的NCDs荧光探针的构建
图4A是NCDs在365 nm处激发时不同体系的荧光光谱。体系中药物CAMP和EMES本身无荧光,无背景影响,但二者都会不同程度的对NCDs的荧光强度产生猝灭现象(图4A中曲线c、曲线b)。可能是药物分子与NCDs表面的-COOH、-OH、-NH等基团之间发生电子转移所致。通过紫外吸收光谱图4B、4C分析,发现NCDs在218 nm处有强吸收,而278 nm处有中等强度的吸收带,推断是芳香碳核心C=C键的π-π*跃迁,说明NCDs具有碳碳共轭结构。而药物EMES在紫外区仅有弱的吸收(图4B曲线b),CAMP在210 nm和286 nm处有两个吸收峰(图4C曲线b),当药物EMES和CAMP加入体系作用后,发现NCDs的吸收峰位置并没有发生改变,而只是218 nm和278 nm处的吸光度有所增加(图4B曲线c、图4C曲线c),恰为药物分子和NCDs二者的吸光强度之和,由此说明药物分子EMES和CAMP影响了NCDs的激发态,产生了动态猝灭作用[16]。再依据Stern-Volmer方程[17]:F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q],式中KSV为猝灭常数,Kq是由扩散过程控制的双分子猝灭速率常数,[Q]是猝灭剂的浓度,τ0为荧光分子平均寿命。通过改变温度,绘制了EMES和CAMP猝灭NCDs的F0/F~[Q]线性曲线,发现KSV随温度升高逐渐增大,推断药物分子EMES和CAMP对NCDs的猝灭机理是动态猝灭。以此构建测定CAMP和EMES的NCDs荧光探针是可行的。
图4 体系的荧光光谱(A)和紫外光谱(B,C)Fig.4 Fluorescence spectra(A) and UV Spectra(B,C) of the system
2.3 测定条件的优化
2.3.1 pH的影响不同pH值的缓冲溶液对体系荧光强度的影响如图5。结果表明,药物对体系NCDs的猝灭能力在强酸和强碱性条件下较差,在弱酸性pH=5.80~6.40范围内荧光猝灭程度较强。实验探讨了pH=6.00的柠檬酸-Na2HPO4、KH2PO4-NaOH、NaAc-HAc、NaH2PO4-Na2HPO4等缓冲溶液对体系的荧光强度的影响。结果药物EMES和CAMP均在pH=6.00的KH2PO4-NaOH缓冲溶液体系中对NCDs有强的荧光猝灭作用。但测定EMES时仅需此缓冲溶液0.50 mL,测定CAMP时则需缓冲溶液1.00 mL。
2.3.2 NCDs的浓度实验发现随着NCDs浓度的增加,体系的荧光猝灭强度不断增大,但当NCDs浓度太大时,体系荧光猝灭强度的增大趋势反而减缓,这可能是NCDs自猝灭的原因。考虑到对体系灵敏度的影响,实验选择用稀释104倍的NCDs溶液1.50 mL。
2.3.3 表面活性剂对体系的影响为确定表面活性剂对实验的影响,实验考察了溴代十六烷基吡啶、曲拉通X-100、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、乳化剂OP-10、十六烷基三甲基溴化铵等表面活性剂对实验体系的影响。结果发现上述几种表面活性剂都对实验体系均无增敏作用,因此实验确定不添加任何表面活性剂。
2.3.4 温度、反应时间及稳定性在实验最佳条件下,30 min内每隔5 min测定一次,之后每隔1 h测定一次,发现药物EMES和CAMP对NCDs的荧光猝灭作用迅速,加入时刻瞬间猝灭且至少可以稳定4 h。但发现体系的荧光猝灭强度受温度的影响,随温度的升高反而下降。因此实验选择在室温下体系反应稳定10 min后进行测定。
2.3.5 共存物质的影响在室温下,按照实验最佳条件,分别研究了浓度为2.1×10-4mol/L的EMES标准溶液,浓度为6.0×10-4mol/L的CAMP标准溶液,体系荧光强度在相对误差≤±5%范围内时,药物辅料对体系的荧光强度的干扰。结果表明,500倍的葡萄糖、糊精、淀粉、乳糖、果糖、蔗糖等均不干扰。
2.3.6 标准曲线按照实验方法,当EMES标准溶液在0.01~1.7 μg/mL范围内,CAMP标准溶液在0.01~1.1 μg/mL范围内时,分别与体系ΔF呈现良好的线性关系。药物EMES的回归方程为:ΔF1=249.65c+13.288,相关系数为R2=0.9989;CAMP的回归方程为:ΔF2=288.01c+14.137,相关系数为R2=0.9972。同时对EMES和CAMP的测定体系的空白溶液平行测定了11次,根据IUPAC规定,用3S0/S计算实验方法的检出限分别为8.0 ng/mL和5.0 ng/mL。
表1为不同检测EMES和CAMP的方法比较,本法对两种药物的检测的线性范围较其他方法较窄,但此方法是对低浓度范围内的药物进行分析测定,检出限也较低,具有一定的灵敏度。
2.4 样品测定
随机抽取EMES片1、片2和CAMP片各10片,分别研磨均匀后,各准确称取相当于一片的量,用40 mL无水乙醇溶解并超声5 min后,于100 mL的容量瓶中用超纯水定容,然后静置10 min后,过滤,按照所确定好的实验方法进行测定,并进行加标回收实验,结果见表2。EMES片1的回收率为96.67%~102.2%,EMES片2的回收率为97.78%~103.3%,CAMP片的回收率为94.74%~101.7%。
表2 EMES和CAMP的测定及其回收率(n=5)
3 结论
以D -麦芽糖为碳源、L-色氨酸为氮源,采用一步水热法合成了高荧光效率的NCDs。合成的NCDs具有尺寸小、分散均匀以及良好的水溶性等特性。在KH2PO4-NaOH缓冲介质(pH=6.00)中,基于NCDs的高荧光性能,构建了测定卡马西平和琥乙红霉素的荧光分析新方法,为碳点的发展和药物的测定都提供了一定的信息。