谐振调幅压电石英晶体分子键裂型传感仪的研制

2022-07-23司士辉陈金华冯浪霞

分析科学学报 2022年3期

张润，司士辉*，陈金华，扶梅，冯浪霞

(1.中南大学化学化工学院，湖南长沙 410083；2.化学生物传感与计量学国家重点实验室(湖南大学)，湖南长沙 410082)

石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance，QCM)是一种以AT切型剪切振动的压电石英晶振作为传感元件的检测技术，该技术可直接精确测量纳克级甚至皮克级物质的质量[1]。QCM具有价格便宜，生物传感无需标记、可在线实时监测生化反应等优点[2]，被广泛地应用于疾病诊断、药物检测、环境检测等多个领域的研究[3]。

目前QCM传感技术通常以晶体表面质量增加使频率信号下降的方式来进行检测，为获得晶体表面结合的传感信号，需要在结合前测定一个频率，反复洗涤，结合后再测定频率，从而得到频率变化，过程复杂繁琐且耗时。Klenerman等[4]通过压电体电噪声监测了抗原抗体的键裂过程，得出了不同分子间相互作用会随着电压幅值升高依次断裂的结论。Cooper等[5]提出键裂扫描(Rupture Event Scanning，REVS)的概念，检测了单纯疱疹病毒与抗体的相互作用，得到键裂力为3 nN。Kurus等[6]通过键裂扫描法得到双链DNA解绕的热力学焓为90±15 kcal/mol。Kolosovsky等[7]通过键裂时施加的电压确定双螺旋DNA分子与金电极的脱附力在30～40 pN。本文基于DDS数字信号发生器设计开发了一种基于调幅调频压电石英晶体的频率检测系统。与文献中采用电噪声信号的方式不同，采用了差频即频率信号的方法得到键裂分离特性，实时监测谐振调幅后的信号变化，通过频率信号和激励电压得到晶体表面的负载质量和键裂力信息。同时，将检测系统设计制作成了分析仪器，通过数控技术调节激励电压和参考频率，实现压电石英晶体的谐振调幅，由谐振调幅引起分子键裂从而得到频率响应变化，以检测晶体表面的负载质量和分子键裂过程。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

AD9854(美国，Analog Devices公司)；PID控温系统(日本，株式会社)；流动注射泵(南京润泽流体控制设备有限公司)；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

Fe3O4纳米磁珠为分析纯，购于上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 分子键裂型压电石英晶体传感仪的原理及构造

1.2.1 仪器原理谐振调幅石英晶体传感仪的工作原理是通过单片机控制数字信号发生器DDS 9854产生频率可调的正弦波，以脉冲信号激励9.98 MHz镀金的压电石英晶体。采用了石英晶体自主谐振电路法和被动激励振荡法两种方式。以谐振电路法在低振幅即电压2 V下测定晶体谐振频率。当谐振调幅时，停止自主谐振测定频率，通过高速继电器切换到被动调幅激励电路中，通过数控放大器调节不同激励电压实现谐振调幅，增大石英晶振表面的剪切动量，从而实现分子键裂。当谐振调幅结束后，再由继电器切换至自主谐振电路中，检测谐振调幅后的频率变化，通过频率变化判断是否发生了分子键裂。原理图如图1所示。

图1 仪器原理示意图Fig.1 Principle diagram of instrument

1.2.2 DDS信号发生器采用直接数字频率合成(Direct Digital Synthesis,DDS)技术以数控振荡的方式产生频率和相位可控的正弦波激励压电石英晶体，通过D/A转换器将数字信号直接转变为模拟信号，产生高精度、高分辨率、低噪声的频率信号。原理如图2所示。

图2 DDS信号发生器原理图Fig.2 Principle of direct synthesizer(DDS) signal generator

采用美国ADI公司的AD 9854高度集成芯片，由Arduino控制产生频率和相位都非常稳定、幅度编程可调的正弦信号。AD 9854内部集成了300 MHz的DDS核、速高性能双路正交DAC、双路14位相位寄存器、调幅模块、两个12位ADC等，AD 9854信号发生器的相位分辨率为0.022°，其频率分辨率为1.07×10-6Hz。

1.2.3 差频方法采用了差频的方法获得谐振频率，以减小温度、晶体老化等因素的影响，以DDS信号发生器产生可调的频率信号作为基准频率源，并不断调节使其与测量晶体频率值在一定范围内。通过差频电路得到测量晶体频率值与基准频率源之间的差值即差频信号，从而提高测量精度。

1.2.4 传感仪构造谐振调幅压电石英晶体分子键裂生物传感仪包括软件部分和硬件部分，实物如图3所示。软件部分包括数据处理模块、信号放大模块、频率存储模块。硬件部分包括调幅电路板、差频电路板、7英寸液晶显示触摸屏、易拆卸检测池(9.98 MHz晶振)、SD卡存储器、PID控温模块、流动注射泵、USB电脑串口。仪器长40 cm，宽39 cm，高16 cm。控制面板包括触摸屏选项和面板按钮，五个按钮依次是程序开始键、中断键、流动注射泵开关键、流向控制键、阀控键，旋钮为流速调节键。本设计使用C++软件对单片机Arduino、PID控温系统、流动注射系统进行编译，打开仪器后，根据实验要求在选择界面选择等幅(2 V)模式和调幅电压模式，选择调幅电压，设置温度及流速，采集数据并自动存储。

图3 仪器实物图Fig.3 Picture of QCM instrument

1.2.5 仪器参数分子键裂型压电石英晶体传感系统参数列入表2。

表1 分子键裂型压电石英晶体传感系统参数

2 结果与讨论

2.1 仪器的稳定性

参考频率默认为10.00 MHz，使用9.98 MHz的压电石英晶振作为检测晶体，开机进行自主等幅(振荡电压2 V)谐振频率检测。待频率波动不超过±1 Hz时，选择5.00～12.00 V的电压调幅，首先以3 min 的等幅模式开始，3 min后暂停频率测定，自动调至5.00 V的激励模式，调幅时间为30 s，摁中断键后切换至谐振频率测定，记录数据3 min。同上以12.00 V的调幅模式激励30 s，以3 min的等幅模式记录传感仪在气相中调幅后的频率变化值。

在气相中，仪器在等幅模式的差频响应值见图4(A)，频率波动大致为一条直线。在检测的50 min内，频率变化的相对偏差为0.981 Hz，波动不超过±1 Hz，频率平均变化为0.08 Hz/min。在调幅模式下频率响应见图4(B)，5.00 V和12.00 V电压激励30 s后，频率迅速升高，在10 s内迅速恢复稳定。尖峰的出现主要是由于高振幅振荡下切换至谐振电路时石英晶体表面的振荡波未衰减完，故出现较大的频率变化，但在短时间内可恢复基频。不同调幅电压激励后的频率变化见图4(C)，总的频率变化为11 Hz，平均变化为0.65 Hz/V，说明在气相环境中仪器在不同调幅电压下频率响应稍有波动，但在一定范围内信号稳定。

图4 (A)等幅模式下气相中的稳定性；(B)5.00 V～12.00 V电压调幅下气相中的稳定性；(C)不同调幅电压气相中的稳定性Fig.4 (A) Instrument stability under gas phase conditions;(B) Stability in gas phase at 5.00V - 12.00 V voltage amplitude Modulation;(C) Vapor phase stability of different amplitude modulation voltages

2.2 键裂实验

2.2.2 纳米磁珠的键裂响应通过谐振调幅激励压电石英晶体以其产生的频率变化来区分不同强度的分子键，其机理如图5所示。图5(A)中QCM的表面发生反应后，频率变化是由不同强度的分子间作用共同产生的，无法区别且影响目标物质的检测。当施加低交变电压时弱结合键断裂如图5B所示。当施加高交变电压时，发生部分或全部强结合键断裂如图5C所示，因此可通过不同调幅电压测定不同键的强弱。

图5 谐振调幅分子键裂方法原理Fig.5 Principle of resonant amplitude modulated molecular bond rupture method

在基本频率下，设置不同的调幅电压，对表面覆盖了纳米磁珠的QCM晶体进行分子键裂实验并记录激励后的频率曲线。图6(A)和6(B)为纳米磁珠涂布干燥后以500 mL/min流速流动注射PBS下的频率响应。200～300 nm纳米磁珠在5 V和12 V调幅30 s后的频率测定见图6(C)，图6(D)为500～600 nm纳米磁珠在8 V和12 V调幅30 s后的频率响应。图6(E)和6(F)为不同粒径纳米磁珠在不同调幅电压下的频率响应。

图6 (A)200～300 nm纳米磁珠调幅后流动注射下的频率响应；(B)500～600 nm纳米磁珠调幅后流动注射下的频率响应；(C)200～300 nm纳米磁珠在5～12 V调幅下的频率响应；(D)500～600 nm纳米磁珠在8～12 V调幅下的频率响应；(E)200～300 nm纳米磁珠在不同调幅电压下的频率响应；(F)500～600 nm纳米磁珠在不同调幅电压下的频率响应Fig.6 (A) Frequency response of 200 - 300 nm nano-magnetic beads under flow injection;(B) Frequency response of 500 - 600 nm nano-magnetic beads under flow injection;(C) Frequency response of 200 - 300 nm nano-magnetic beads diagram at 5 - 12 V;(D) Frequency response of 500 - 600 nm nano-magnetic beads diagram at 8 - 12V;(E) Frequency response diagram of 200 - 300 nm nano-magnetic beads under different amplitude modulation voltages;(F) Frequency response diagram of 500 - 600 nm nano-magnetic beads under different amplitude modulation voltages

如图6(A)和6(B)所示，两种粒径的纳米磁珠在流动注射PBS的条件下频率稍有波动但大致成一条直线，说明在磁珠流动注射条件下不脱落。如图6(C)所示，在低电压激励后仪器频率几乎无变化，12 V激励后频率明显升高，平均升高了92 Hz，振掉了80.96 ng的200～300 nm纳米磁珠。如图6(E)所示，在20 V电压激励后频率上升为123 Hz，根据Sauerbrey方程，表面振掉108.24 ng(即5.5%)200～300 nm的结合磁珠。由图6(D)可得500～600 nm纳米磁珠在8V电压激励后仪器频率上升97 Hz，12 V电压激励后频率升高243 Hz，表面振掉213.84 ng 的500～600 nm纳米磁珠。由图6(F)可得在8 V电压激励后传感仪频率升高并随电压升高小幅增加。20 V后频率变化为329 Hz，根据表面振掉289.52 ng 的500～600 nm纳米磁珠。

图7 粒子在晶体表面的运动模型Fig.7 The movement model of particleson crystal surface

表2 调幅谐振QCM传感仪检测不同粒径纳米磁珠的实验结果

其中f0为晶体空载时谐振频率和参考频率的差值，即基本频率。f1为滴加纳米磁珠晾干冲洗后晶体的频率差值。Δf为晶体负载纳米磁珠后的频率变化值。fup为键裂发生后的频率上升值。F为计算得到的键裂力。根据键裂力公式，不同粒径的纳米磁珠，沉积的质量相同，计算得到的键裂力相似，即不同粒径的纳米粒子检测出的氨基与金原子键裂力一致。氨基与金原子的相互作用与硫金键相似，本仪器测出的键力值与文献中原子力显微镜测得的Au-S键力值2±0.5 nN相近[8]。纳米磁珠沉积于晶体表面得到的频率值数据无规律主要是因为旋转涂布后形成的结合层表面不均匀，因此存在一定的误差。由表数据可得，纳米磁珠未被全部甩脱，其主要原因是带氨基修饰的纳米磁珠具有与硫醇相似的性质，当磁珠滴在晶体表面，与金电极接触，氨基脱氢，氮原子与金结合。当大量氨基与金原子结合时，产生较大的结合力，调幅电压激励产生的振幅能量无法打开全部的结合键，因此仅是部分频率升高。