基于UHPLC-Q-Exactive-MS技术的短序蒲桃叶岩白菜素新衍生物的快速发现

涂海声，邱嘉琦，徐 雅，张 靖，3，丘小惠，3，黄志海，3，李 钟，徐 文，3*，韩 彬*

（1.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006；2.广州中医药大学第二附属医院，广东省中医院，广东 广州 510006；3.广州市中药活性成分手性研究重点实验室，广东 广州 510006）

桃金娘科（Myrtaceae）蒲桃属（Syzygium）植物具有重要的药用和食用价值，代表性植物如蒲桃［1］、丁香［2］、海南蒲桃、乌墨［3］、滇南蒲桃等，其根皮茎叶果均可入药或食用。已有研究表明，蒲桃属植物中含有丰富的化学成分，如黄酮类［4］、萜类［5］、酚酸类［6］、间苯三酚类［7-8］等，且具有抗炎［9］、抗氧化［10］、抗菌［11］、降血糖［12-13］等广泛的生物活性和药理作用。

本属植物短序蒲桃（Syzygium brachythyrsumMerr.et Perry），又名野冬青果、山蒲桃、麻栗果等，分布于云南、广东、广西等地［14］。其果实与茎叶以“野冬青果”之名收载于《云南中草药》，具有止咳平喘的功效，主要用于寒性哮喘、哮喘等［15-16］，其作为特色民族中草药在西南地区有广泛的应用。然而，目前尚未见短序蒲桃药学相关的系统报道，其化学成分、生物活性、药理作用等方面的研究仍为空白。

本课题组前期首次开展了短序蒲桃叶的化学成分和生物活性研究［17］，分离得到2 种新岩白菜素衍生物（图1）和一系列岩白菜素衍生物，首次证实了蒲桃属植物中富含大量的岩白菜素类衍生物。岩白菜素因具有良好的止咳作用，已作为上市药物收录于《中国药典》［18］。近年来大量研究表明岩白菜素具有降糖、保肝等多种潜在的治疗作用，以及抗炎、抗肿瘤、抗心律失常、镇咳祛痰等药理活性［19-21］。但岩白菜素的生物利用度较低，为充分发挥其药用价值，提高其生物利用度及生物活性，从天然来源或人工合成手段发现活性更高的岩白菜素衍生物成为新的研究热点。

图1 新化合物短序蒲桃酚A（化合物19，A）及短序蒲桃酚B（化合物18，B）的结构图［17］Fig.1 Structures of brachythol A（compound 19，A）and brachythol B（compound 18，B）［17］

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）已逐步发展成为一项常规分析技术，将LC-MS 尤其是高分辨质谱技术应用于天然药物化学研究，是对传统的天然产物分离技术的有力支撑。结合高效液相色谱强大的分离能力与质谱技术的高灵敏度、高选择性以及准确性的特点，可实现中药复杂化学成分导向分离和鉴定，有助于快速发现新颖和感兴趣的天然产物。在课题组前期研究基础上，本研究拟采用超高效液相色谱-串联四极杆轨道阱质谱（UHPLC-Q-Exactive-MS）技术［22-24］，通过采集模式化合物的高分辨质谱信息，结合特征碎片离子信息和化合物质谱裂解规律，并与前期分离的实体成分和SciFinder Scholar 文献数据库进行对比，对短序蒲桃叶中岩白菜素类等具有没食子酸糖苷结构的类似成分进行快速分析和鉴定，发现潜在新颖的岩白菜素衍生物成分，为短序蒲桃叶的物质基础研究和后续开发奠定化学基础。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Q-Exactive Plus hybrid Orbitrap 质谱仪与Accela 超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific）。LK/CSJ-20型超声波清洗机（成都老肯科技股份有限公司），BT-125D 型十万分之一分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），Eppendorf-5424高速离心机（艾本德中国有限公司）。HPLC级甲醇、乙腈和甲酸（默克公司），实验用水为Millipore超纯水（Millipore公司，18.2 MΩ·cm）。

短序蒲桃叶（PT，采自云南省西双版纳傣族自治州勐海县），经暨南大学周光雄教授鉴定为桃金娘科蒲桃属短序蒲桃（S. brachythyrsum）的茎和叶，样本（编号：201903S）保存于广东省中医院中药制剂室标本库。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 参考前期［25］的样品处理方法，取少量短序蒲桃叶乙酸乙酯提取物浸膏100 mg，采用10 mL 80%甲醇超声10 min，15 000 r/min 离心10 min，取上清液适量，过0.22 µm 微孔滤膜，待分析。

1.2.2 对照品溶液制备 精密称取本实验室前期分离得到的对照品岩白菜素、去甲岩白菜素、短序蒲桃酚A、短序蒲桃酚B适量，加适量甲醇溶解稀释后制得20µg/mL的单一对照品储备液。

1.2.3 色谱参数 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（1.8 µm，2.1 mm × 100 mm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；流速为200 µL/min。梯度洗脱：0～2 min，17% A；2～3.5 min，17%～23% A；3.5～6 min，23%～45% A；6～13 min，45%～90% A；13～15 min，90% A；15～16 min，90%～17%A；16～19 min，17%A。

1.2.4 质谱参数 采用电喷雾离子源（ESI）负离子模式采集质谱数据。喷雾电压为-3 700 V；鞘气为40 arb，辅助气为15 arb，探针及毛细管温度均为350 ℃，一级扫描分辨率为35 000，质谱扫描质量范围为m/z130～2 000，二级质谱采用数据依赖性采集（DDA），分辨率为17 500，碰撞能量（NCE）为30%。质谱采集为Xcalbur软件（美国Thermo Fisher Scientific），用于记录和整合色谱图。质谱裂解规律参考模拟软件Mass Frontier 6.0（美国Thermo Fisher Science）。

2 结果与讨论

2.1 短序蒲桃叶酚酸类成分的LC-MS分析

采用UHPLC-Q-Exactive-MS 负离子模式对短序蒲桃叶酚酸类部位进行分析，其LCMS 总离子流图如图2。对图2 中主要色谱峰进行LC-MS鉴定，策略为：①根据前期化学成分研究获取的主要模式成分进行质谱裂解规律研究，按照质谱学一般规律结合Mass Frontier 6.0模拟软件推测模式成分母核的裂解规律并总结特征碎片离子；②根据母离子Orbitrap 高分辨质谱数据结合N 规律、同位素峰规律确定未知成分的元素组成；③根据母离子、多级质谱信息和精确相对分子质量，对短序蒲桃叶中的酚酸类成分进行鉴定、归类与分析；④将部分已知成分与前期已分离得到的实体化合物或文献进行对照。从短序蒲桃叶中共鉴定出54 种酚酸类成分，其保留时间、高分辨母离子信息、质量偏差、多级质谱信息及可能的结构信息见表1。结果表明，短序蒲桃叶中岩白菜素衍生物等酚酸类成分主要在保留时间1～10 min范围内出峰。

表1 短序蒲桃叶中酚酸类成分的UHPLC-Q-Exactive-MS鉴定结果Table 1 Identified results of phenolic acids in PT by UHPLC-Q-Exactive-MS

（续表1）

图2 短序蒲桃叶酚酸类提取物的总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of PT phenolics extract the peak numbers denoted were the same as those in Table 1

2.2 岩白菜素模式成分的Orbitrap质谱特征裂解规律研究

采用LC-Orbitrap MS 对特征碎片离子初步提取和分析，结果表明短序蒲桃叶中的酚酸类成分以岩白菜素、去甲岩白菜素和课题组分离得到的新化合物短序蒲桃酚B（Brachythol B）的衍生物为主，为此本研究对上述3 种模式成分的质谱裂解规律进行归纳，并总结其特征碎片和关键的中性丢失，为未知成分的快速发现奠定基础。

2.2.1 岩白菜素类化合物的质谱裂解规律分析 岩白菜素为没食子酰葡萄糖类化合物，在Orbitrap 质谱中形成m/z327.070 5（C14H15O9）的［M-H］-准分子离子峰，其在二级质谱中主要碎裂成m/z312.046 6、249.038 8、234.015 2、207.028 1、192.004 5 等碎片。根据其元素组成及相关文献［26-27］，推测岩白菜素的质谱裂解主要为发生在C环的内部裂解，其中m/z249.038 8推测为发生在3，4位逆狄尔斯-阿尔德裂解（retro-Diels-Alder fragmentation，RDA）形成的3，4A 碎片离子（图3），并进一步在A 环的甲基发生均裂形成m/z234.015 2的自由基离子。由C环10b，4a位发生非典型RDA裂解导致C4H8O4（120 Da）残基的中性丢失，形成m/z207.028 1 的10b，4aA 特征离子（图3）。10b，4aA 特征离子在A 环进一步均裂失去甲基形成m/z192.004 5的自由基离子。通过与前期分离的实体化合物进行保留时间及质谱信息比对，确定峰11为岩白菜素，峰5为其异构体。

图3 对照品岩白菜素的色谱图（A）、二级质谱（B）及其特征质谱裂解规律（C）Fig.3 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of bergenin

以岩白菜素的上述5 个特征碎片离子为依据，可快速获得具有岩白菜素相同母核的衍生物成分。经对主要色谱峰的精确母离子和多级质谱信息进行分析，发现化合物5、19、24、31、35、37、39、41 和43～52 均具有与岩白菜素相同的特征离子峰及相似的质谱裂解途径，关键的中性丢失和精确的元素组学信息表明它们为多种酚酸取代的岩白菜素衍生物。以19 号峰为例，说明化合物的鉴定过程及其裂解规律。化合物19 的保留时间为4.6 min，在负离子模式下形成［M-H］-的准分子离子峰m/z479.083 2，推测分子式为C21H20O13。其在二级质谱中进一步碎裂形成特征碎片离子m/z327.070 3、312.047 2、271.044 9、249.039 2、234.015 4、207.027 9、169.012 4。其中m/z327 为失去没食子酰取代基生成的岩白菜素母核碎片，m/z312 为进一步均裂脱去8 位甲氧基形成的碎片的碎片，3，4A 碎片以及岩白菜素特征碎片离子3，4A、10b，4aA 等。其主要碎裂途径与上述岩白菜素基本一致，可判断其为岩白菜素类衍生物。根据其元素组成及m/z169.012 4取代基碎片离子，可推测化合物19为没食子酰取代的岩白菜素衍生物。通过与前期分离的实体化合物进行保留时间及质谱信息比对，确定其为新化合物短序蒲桃酚A。

通过对Orbitrap 负离子质谱信息分析及与岩白菜素特征离子峰比对及筛选，发现潜在的岩白菜素类异构体及衍生物共19 种，主要为没食子酰（化合物19、31、37、39）、香豆酰（化合物45、46、49）、阿魏酰（化合物50、52）等取代的岩白菜素类衍生物。均为在蒲桃属植物中首次发现。

2.2.2 去甲岩白菜素类化合物的质谱裂解规律分析 去甲岩白菜素（Norbergenin，峰7）为岩白菜素岩A 环上的甲氧基被羟基取代而成，因此两者裂解方式相似。去甲岩白菜素在Orbitrap 质谱中形成m/z313.055 2（C13H13O9）的［M-H］-峰，在二级质谱中主要碎裂成m/z235.024 0、207.028 9、193.013 1特征离子。其中m/z235.024 0 和193.013 1 碎片的裂解途径与岩白菜素一致，均为分别发生在C 环3，4 位和10b，4a位的RDA裂解形成3，4A碎片离子和10b，4aA特征离子（图4）。此外，C环3，4位发生裂解后进一步重排，形成m/z207.028 9 的特征离子。上述3 个特征碎片离子峰可作为去甲岩白菜素类衍生物的诊断离子，用于相关色谱峰的鉴定。

图4 对照品去甲岩白菜素的色谱图（A）、二级质谱（B）及其特征质谱裂解规律（C）Fig.4 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of norbergenin

以化合物30 为例，其保留时间为6.4 min。在负离子模式下，其准分子离子峰［M-H］-为m/z433.076 0，通过精确质谱测定推测其分子式为C20H18O11。分析二级质谱图发现其主要碎片离子为m/z313.055 9、235.022 9、193.012 4，推测其分别为准分子离子峰失去取代基生成的去甲岩白菜素母核碎片、3，4A 碎片及10b，4aA 碎片，初步判断其为去甲岩白菜素类衍生物。根据元素组成推测其取代基为水杨酸基团，该化合物为水杨酸去甲岩白菜素，通过SciFinder Scholar 数据库搜索，推测其为潜在的新成分。

基于上述策略，发现潜在的去甲岩白菜素类异构体（化合物3）及衍生物共11 种，主要为没食子酰（化合物4、12、14、22）、阿魏酰（化合物40、42）及咖啡酰（化合物28）取代的去甲岩白菜素。均为从蒲桃属植物中首次发现，其中化合物30（水杨酸去甲岩白菜素）为潜在的新化合物。

2.2.3 新型岩白菜素衍生物短序蒲桃酚B类化合物的质谱裂解规律分析 短序蒲桃酚B（Brachythol B，峰18）为本实验室前期［17］首次从短序蒲桃叶酚酸类成分中发现并分离得到的新型岩白菜素类衍生物。短序蒲桃酚B 在结构上为岩白菜素C 环2，3 位上羟基被六羟基联苯甲酰基团（HHDP）取代形成的新衍生物。在Orbitrap 一级质谱中，短序蒲桃酚B 形成m/z629.076 7（C28H21O17）的［M-H］-峰，其进一步碎裂成m/z300.997 6、275.018 8 2 个特征碎片离子。推测其质谱裂解途径主要为C 环内部发生断裂并重排，形成与HHDP 基团相关的碎片离子（图5），其中特征离子m/z275.018 8 为HHDP 基团7'，7''位上酯基裂解后重排形成的碎片离子，而m/z300.997 6 为HHDP 残基经脱氢重排后形成的鞣花酸特征碎片离子，该碎片离子因具有高度的共轭而较为稳定，故离子丰度最强。此外，C 环上的内部裂解还形成了岩白菜素残基碎片如m/z249.038 8和207.028 0，但离子丰度较低，可用于佐证岩白菜素的存在。而HHDP残基碎片m/z300.997 6和275.018 8具有较高的离子丰度，且具有特异性，因此可作为短序蒲桃酚B 母核的特征碎片离子。由此将上述两种离子作为短序蒲桃酚B 的诊断离子对其衍生物进行筛选和鉴定分析。

图5 对照品短序蒲桃酚B的色谱图（A）、二级质谱（B）及其特征质谱裂解规律（C）Fig.5 Chromatogram（A），MS2 spectrum（B）and proposed fragmentation pathway（C）of brachythol B

化合物38 的保留时间为7.6 min。在负离子模式下，其准分子离子峰为m/z659.086 6［M-H］-，分子式为C29H24O18。通过分析二级质谱碎片发现其主要碎片离子m/z300.997 7、275.018 6 与上述短序蒲桃酚B 的母核特征峰一致，可初步判断其为短序蒲桃酚B 类衍生物。根据其元素组成可确定化合物38为甲氧基短序蒲桃酚B，为潜在的新成分。

同理可推断出峰26 和33 分别为短序蒲桃酚B 同分异构体HHDP-岩白菜素和没食子酰短序蒲桃酚B。同时筛选出3 个具有HHDP 结构的没食子酰-HHDP-葡萄糖苷衍生物（化合物2、9、10）。短序蒲桃酚B及其衍生物均为潜在的新化合物。

综上所述，通过对Orbitrap 负离子质谱信息进行分析及与特征离子峰比对和筛选，从短序蒲桃叶酚酸类成分中推测出岩白菜素类衍生物34 种，非岩白菜素类化合物4 种，均为首次在蒲桃属植物中发现。其中9种岩白菜素类衍生物为首次发现的新化合物，1种为以短序蒲桃酚B为代表的新型岩白菜素类衍生物构型。

2.3 其他成分

除岩白菜素类化合物外，本研究还从短序蒲桃叶酚酸类成分中鉴定出17 种黄酮及其他酚酸类成分，并发现1种新化合物没食子酰二甲基没食子酸（Galloyl-O-di-methylgallate）。

2.4 讨 论

本文采用UHPLC-Q-Exactive-MS技术对短序蒲桃叶中岩白菜素类化合物进行快速分析，从中发现或推测出30余种岩白菜素及其衍生物，包括多种潜在的新型岩白菜素类衍生物构型，并总结了岩白菜素类、去甲岩白菜素类及新构型短序蒲桃酚B类3种岩白菜素化合物构型的质谱裂解规律，丰富了岩白菜素类化合物的天然来源，为其快速鉴定及进一步的成分分离、结构修饰及活性筛选提供了参考。化合物生物活性与其取代基团息息相关，Kashima等［19］研究表明，当岩白菜素取代基中含有苯甲酰基或苯甲酰基结构时具有较强的生物活性。本研究首次发现的多种短序蒲桃酚B衍生物具有六羟基联苯甲酰基团（HHDP），且前期研究［17］也证实短序蒲桃酚B具有较强的抗炎及抗氧化活性，推测这些成分具有良好的生物活性，对其进行深入的化学成分研究、活性评价和构型关系研究具有重要意义。

本研究仅对少数推测出的化合物进行标准品比对，大量的异构体成分无法获得结构确证，存在一定的局限性。基于UHPLC-Q-Exactive-MS 技术，后续拟开展短序蒲桃叶的导向分离，进一步明确短序蒲桃叶的物质基础，为该民族中草药的开发和药理药效学评价奠定基础。

3 结 论

本研究利用超高效液相色谱-串联四极杆轨道阱质谱分析了特色民族药物短序蒲桃叶中的酚酸类成分，通过条件优化，短序蒲桃叶中的岩白菜素类成分得到较好的分离和质谱响应。实验发现，短序蒲桃叶中岩白菜素类成分在负离子模式下易形成［M-H］-母离子峰。根据获得的母离子、多级质谱信息和精确分子量，对比对照品的质谱信息，并参考已有文献，从短序蒲桃叶酚酸类成分中推测出54种成分，其中38个成分为首次从蒲桃属植物中发现（包括34种岩白菜素类化合物、4种非岩白菜素类化合物），除已报道的岩白菜素类成分外，还发现了7 个以短序蒲桃酚B 为基本母核的潜在新岩白菜素衍生物。上述发现为短序蒲桃叶的化学成分及其药效物质基础研究奠定了基础，同时为进一步研究岩白菜素类化合物的生物活性及其构效关系提供了新的依据。