基于实时无标记技术研究流式分选后细胞活性的检测方法

2022-07-22李艳伟王佳佳邢月婷黄莹莹宋兴辉

分析测试学报 2022年7期

李艳伟，王佳佳，邢月婷，郭春，黄莹莹，宋兴辉，黄琼

（浙江大学医学院公共技术平台，浙江杭州 310058）

近年来，利用流式分选技术精准分离、纯化的活细胞被广泛用于基础医学和临床医学、新药筛选、生物材料、疾病机理等领域的研究［1-6］。由于分选后的细胞大多数为群体中的低表达细胞，因此用于活性检测的细胞用量以及检测后的细胞能否重新利用显得尤为重要，也对分选后细胞活性的检测指标和检测方法提出了更高的要求。

细胞活性是判断细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标，细胞活性的检测相当于细胞增殖能力或凋亡能力的测定，其检测指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性、代谢活性、细胞分裂增殖等。目前，细胞活性常规检测方法有四甲基偶氮唑盐比色法（MTT 法）、细胞计数试剂盒法（CCK-8）、流式细胞法等［7］，这些方法大都需要对细胞在特定时间点进行消化、重悬、染色标记等处理，步骤多、检测点有限，往往会遗漏细胞变化的时间点，增加检测的盲区。

流式细胞分选技术是目前纯化活细胞最常见的技术［8］，分选后的细胞大多数需继续培养后再深入研究其功能，即使是分选后的细胞直接用于进一步功能研究，也需要保持在一定活性状态下，因此分选后细胞的活性不仅可以说明流式分选的水平也为细胞后续功能研究提供了保障。检测细胞活性的方法很多［9-11］，但很少有研究对分选后的细胞活性进行检测。

实时细胞功能分析（Real time cellular analysis，RTCA）是一种无需标记，可实时动态监测细胞活性的分析技术，该技术的核心是将微电子细胞传感器芯片整合到表面适于细胞贴附与生长的细胞检测板底部的微孔膜上。微电子芯片测定的电阻抗转化为细胞指数（Cell index，CI值）即可反映细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁程度等一系列生理状态［9，12］。虽然RTCA 法的应用日趋广泛，但鲜有报道将其用于分选后细胞活性的检测尤其是长效动态活性的实时检测。本研究以分选前后的人肾上皮细胞系HEK293T（简称293T）细胞为例，以CCK-8 法、流式细胞法作为参照，探讨了RTCA 法对分选前后细胞增殖活性的检测情况，从而建立了简便、实时动态长效检测分选后细胞活性的方法，以期为分选后活细胞的功能研究提供保障和检测手段。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

293T细胞（浙江大学基础医学院）；流式分选专用质控微球（美国Beckman Coulter 公司）；流式分析专用质控微球（美国BD 公司）；凋亡试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）；增殖CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM 培养基、血清、胰酶、双抗（美国Gibco 公司）；96 孔板、离心管、无菌流式管、40µm 细胞筛（上海普飞生物技术有限公司）；磷酸缓冲盐溶液（上海博升生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

MoFlo AstriosEQ超高速流式细胞分选仪（美国Beckman Coulter 公司）；LSRFortessa 流式细胞分析仪（美国BD 公司）；RTCA-SP高通量实时细胞功能分析仪（德国Roche公司）；SynergyMx M5多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 分选前样本制备复苏293T 细胞并接种于含10%磷酸缓冲盐溶液及1%双抗的DMEM 培养液中，置于37 ℃、5%CO2的孵箱内孵育并传代3次后，待细胞长至对数生长期时（密度为70%～80%），弃上清，加入0.25%胰酶消化，300 g 离心5 min，弃上清，用无菌磷酸缓冲盐溶液制备成浓度为1 ×107个/mL 的单细胞悬液作为分选前样本，置冰浴中备用，待上机分选前使用40µm 的细胞筛网过滤。整个操作过程需在无菌环境下完成。

1.3.2 流式分选参数调试所用的Beckman MoFlo AstriosEQ分选系统具有超高速分选性能［13］，使用100 µm 喷嘴分选细胞，设定鞘液压力为0.2 MPa，样本与鞘液的压力差为0.002 MPa，分选模式为Purty 模式。调节液流与激光垂直正交并校准激光光斑图像。准备分选质控微球原液1 滴加入800 µL ddH2O 中混匀并校准激光延迟，完成仪器质控检测CV、电压、median 等信号。计算液滴延迟，校准液流偏转角度。打开分选监测软件（Summit 6.2），建立实验方案，分别激活前向散射光信号（FSC）、侧向散射光信号（SSC）、目标荧光通道，建立FSC（A）/SSC（A）散点图并圈定目标细胞群，建立FSC（A）/FSC（H）散点图并圈定单细胞群，排除黏连细胞、死细胞、细胞碎片等。

1.3.3 流式细胞分选将预先制备好的1 mL 细胞收集液加入到15 mL 离心管中并置于收集架内，用40µm细胞筛过滤细胞悬液作为分选前样本，调整上样细胞浓度为1×107个/mL，设置收集管内分选细胞数为5×106个/mL。分选前后细胞均置于冰浴中用于后续活性检测。

1.3.4 流式细胞分析参数质控调试 BD LSRFortessa 流式细胞分析仪具有检测速度快、灵敏度高的特点，采用仪器参数设置及追踪（CST）自动校正程序：取涡旋后的CST微球原液1滴加入500µL ddH2O中混悬，上样采集进行仪器CV、PMTV、mean、median等参数校正。

1.3.5 分选前后细胞的流式凋亡检测选取分选前、后的293T 细胞悬液，于4 ℃、300 g 离心5 min，弃去上清液，按照凋亡试剂盒稀释5×结合缓冲液为1×结合缓冲液，取500µL 1×结合缓冲液重悬细胞，调整重悬后细胞浓度为5×105个/mL，设3 个复孔。每管加入Annexin V-FITC 染色液5µL 和碘化丙啶（PI）染色液10µL，于冰浴中避光孵育5 min，进行流式细胞凋亡检测。按常规两色标记，首先以未染色管样本调节电压，单标管调节荧光补偿，以Annexin V-FITC 为横坐标、PI 为纵坐标作流式图。分析时以Annexin V-FITC 单阳细胞比例确定细胞早期凋亡情况，以Annexin V-FITC/PI 双阳细胞比例确定细胞晚期凋亡情况，以Annexin V-FITC/PI双阴细胞比例确定细胞活性情况。

1.3.6 分选前后细胞的CCK-8 增殖检测选取分选前、后的293T 细胞悬液，于4 ℃、300 g 离心5 min，弃上清液，加入10%血清的DMEM 培养液稀释细胞浓度为2 × 104个/mL，取100 µL 细胞液分别接种在96 孔细胞培养板中，每个检测时间点设置5 个复孔，每孔分别加入10 µL 增强型CCK-8 试剂，于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育。空白对照中未加入细胞。实验组分别于0、24、48、72 h 检测450 nm 处的吸光度（D450）值，计算细胞的平均吸光度，分别绘制细胞增殖曲线，确定细胞增殖活性。

1.3.7 分选前后细胞的RTCA 检测向96 孔增殖板中加50µL 的DMEM 细胞培养液测定基线。选取分选前、后浓度为1×105个/mL的293T细胞悬液，于4 ℃、300 g离心5 min，去上清液，加入10%血清的DMEM 培养液重悬细胞，浓度为5×104个/mL，取100µL 细胞液加入上述增殖板中，使每个孔包含5 000 个细胞，设置4 个复孔，超净台内静置30 min 后放入检测仪，设定每15 min 进行一次CI 值检测，连续检测72 h，以细胞CI值为Y轴，时间t为X轴绘制293T细胞增殖曲线［14-15］。

1.4 统计学处理

实验数据均为每次实验的至少3 个重复，所用图片与数据分别为具有代表性的实验结果。流式实验结果采用FlowJo_V10 软件进行处理分析，统计结果采用GraphPad Prism 7 软件进行分析，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较组间统计差异。其中，P＜0.05 表示实验结果具有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 流式细胞凋亡检测

细胞凋亡作为细胞活性检测的指标之一，是一种程序性死亡过程，早期凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻与Annexin V 结合，晚期凋亡时细胞膜具有通透性且仍保留PS 外翻特性，PI 染料可进入核内与DNA 结合，坏死的细胞为裸核，只有PI 与DNA 结合［16-17］。因此利用流式凋亡图可以区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、坏死细胞，细胞凋亡率等于3 个复孔细胞凋亡率的平均数± 标准方差。根据细胞凋亡率可以判断分选前后细胞的凋亡情况，统计分析流式凋亡图中的活细胞比例则可以判断分选前后细胞活性情况。本实验中，细胞分选后需在4 ℃条件下离心、重悬、染色孵育、上机检测，其中离心、重悬吹吸操作等会增加细胞凋亡的比例，因此需要记录大量细胞数据进行分析，实验选取有代表性的流式细胞凋亡图（图1A）进行展示。计算得到分选后细胞凋亡率为（3.85 ± 0.008）%，分选前细胞凋亡率为（14.09 ± 0.021）%，进一步统计分析分选前后的细胞凋亡率发现，分选后细胞凋亡率较分选前下降明显，具有统计学差异（P＜0.05）（图1B）；统计分选前后的活细胞比例发现，流式分选后细胞活性高于分选前，具有显著性统计学差异（P＜0.001）（图1C）。

图1 流式细胞法检测分选前、后293T细胞的凋亡结果Fig.1 Apoptosis results of 293T cells before and after sorting by flow cytometry A. apoptosis results；B. apoptosis statistics chart of 293T cell，*P ＜0.05；C. activity statistics chart of 293T cell，***P ＜0.001

2.2 CCK-8增殖检测

细胞增殖是活细胞的重要生理功能之一，而细胞代谢活性检测基于被细胞线粒体脱氢酶还原为黄色的水溶性甲臜产物，该黄色甲臜物的吸光度与活细胞数量成正比，可间接反映活细胞的数量［18-19］。实验中，需将淡红色的CCK-8试剂直接加入到细胞培养液中混匀（试剂颜色与酚红颜色接近，需避免漏加或多加［20］）。连续孵育0、24、48、72 h，分别进行吸光度的检测。结果显示，293T 细胞的吸光度（D450）随着细胞孵育时间的增加而增加，随后增殖曲线进入平台期，细胞吸光度（D450）增幅越来越小（图2A）。统计分析发现，分选后293T 细胞的吸光度在孵育24 h 后高于分选前，具有显著性统计学差异（P＜0.001）（图2B）。

图2 CCK-8检测法检测分选前、后293T细胞的增殖结果Fig.2 Proliferation results of 293T cells before and after sorting by CCK-8 detection method A. the absorbance value of 293T cells over time；B. proliferation activity statistics chart of 293T cells，***P ＜0.001

2.3 RTCA实时增殖检测

RTCA 法操作简单，具有实时、自动、无标记、高通量的优势［21-22］。实验将细胞接种于96 孔增殖板中，连续动态检测72 h，观察细胞实时动态增殖曲线。结果显示，CI 值变化与细胞的活性成正比，细胞活性越好，贴壁生长的数量就越多，增殖板孔底微电子芯片的电阻抗增加越快，CI 值增加越快。当增殖板孔中的细胞铺满孔底时，孔底微电子芯片的电阻抗不再变化，CI值不再增加，曲线进入平台期。结果显示，分选后细胞动态增殖曲线的CI 值高于分选前（图3A）。统计分析发现，分选后293T 细胞的增殖活性明显高于分选前，具有极显著性的统计学差异（P＜0.000 1）（图3B）。

图3 RTCA检测法检测分选前、后293T细胞的增殖结果Fig.3 Proliferation results of 293T cells before and after sorting by RTCA detection method A. cell proliferation index value of 293T cells over time；B. proliferation activity statistics chart of 293T cells，****P ＜0.000 1

2.4 3种检测方法的比较

比较RTCA法、CCK-8法、流式细胞法对分选后细胞活性的检测结果（图4）发现，RTCA法检测的细胞活性高于CCK-8法，具有统计学差异（P＜0.01）；RTCA法检测的细胞活性明显高于流式细胞法，具有统计学差异（P＜0.01）；CCK-8法检测的细胞活性与流式细胞法检测的细胞活性无明显差异（P＞0.05）。

图4 3种方法检测分选前、后293T细胞活性的统计结果Fig.4 Statistical results of three detection methods to detect the activity of 293T cells before and after sorting**P ＜0.01，nsP ＞0.05

综合比较3种细胞活性检测方法（表1）。RTCA 法操作最简单，细胞用量少，全程无额外刺激干扰，结果最全面、客观；CCK-8 法细胞用量小、成本也相对较低，缺点是需要耗费较长时间来摸索最佳检测条件［23］。这两种方法检测后的细胞可继续用于细胞其他功能的测定。流式细胞法可以定量计算细胞的凋亡率及活性率，但细胞用量大，操作步骤多，实验成本较高，而且检测后的细胞直接流入废液，不可用于后续实验。CCK-8 法和流式细胞法，检测过程需要人工操作，自动化程度不高；而RTCA 法在细胞铺板后，会实时自动监测细胞增殖变化的整个过程，自动化程度高［24］。因此，RTCA 法具有操作流程极简、无需标记、检测灵敏度高、可实时动态监测细胞整个生长变化过程的优势，可作为实时便捷的分选后细胞活性检测方法，检测的细胞长效活性结果可为分选后细胞功能的深入研究提供保障，为基础与临床细胞活性研究提供检测手段。