基于PET效应检测8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶的荧光传感器

刘 萍，金 东，李哲建，乔成芳

（1.商洛学院 化学工程与现代材料学院，陕西 商洛 726000；2.陕西省尾矿资源综合利用重点实验室，陕西商洛 726000；3.南京邮电大学 材料科学与工程学院，江苏 南京 043000）

生物体的生命活动经常会受到内、外致突变因素的影响，引起DNA 碱基损伤。8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）是DNA氧化损伤的重要标志［1］。8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）是一类存在于生物体内能够参与DNA 损伤修复过程的蛋白酶，可与DNA 双链进行非特异性结合，选择性识别并切除DNA 双链中的8-oxoG，形成脱嘌呤（AP）位点，并在一系列修复酶协助下完成DNA 分子的修复［2］。人体中8-氧鸟嘌呤DNA 糖基化酶（OGG1）称为hOGG1。研究表明：OGG1的异常与多种疾病以及癌症密切相关［3］，其已成为多种疾病发展状态的重要标志物和癌症的潜在治疗靶点，因此实现对OGG1 活性的快速、灵敏检测对于基础生化研究和临床医学发展具有十分重要的意义。

检测OGG1 的传统方法有凝胶电泳法［4］、放射性检测法［5］、高效液相色谱法（HPLC）［6］、比色法［7］、电化学法［8］和荧光分析法［9-10］等，如蒋健晖课题组［7］基于探针末端保护原理，利用表面修饰寡核苷酸的AuNP作为识别探针，发展一种检测hOGG1活性的比色分析法。Liu等［8］基于hOGG1对8-oxoG 的识别特性，设计了包含8-oxoG及亚甲基蓝分子（MB）的DNA探针，利用方波伏安法（SWV）表征hOGG1的活性，将酶活性成功转化成物理信号输出，建立了目标蛋白与电化学信号之间的量化关系，构建了灵敏的hOGG1 电化学传感器。刘斌等［9］利用标记荧光的发夹结构分子信标，设计含有8-oxoG 且有标记的双链DNA，利用hOGG1的特异性功能解链，再用适体与解旋链形成复合物，通过实时监测8-oxoG 切割过程建立了一种hOGGl 活性分析的新方法。李峰课题组［10］发展一种核酸外切酶ExoⅢ辅助的等温循环信号放大策略，实现了对hOGG1活性的荧光检测。但多数方法存在灵敏度差、操作复杂、分析耗时、仪器昂贵、污染环境等不足，极大地限制了方法的推广应用。

本文基于G碱基与羧基荧光素（FAM）产生光诱导电子转移（PET）效应［11-12］，利用OGG1酶能特异识别含有8-oxoG 的双链DNA 的特点，建立了一种检测OGG1 酶活性的荧光新方法。该方法具有操作简便、成本低等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600 型日立荧光分光光度计（日本日立公司），便携式pH 计、XS105DU 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），TGL-18C离心机（上海安亭科学仪器厂），移液枪（北京大龙公司），恒温水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司）。

三（羟甲基）氨基甲烷（Tris，上海青析化工科技有限公司），NaCl、EDTA、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），MgCl2、Cd（NO3）2·4H2O（上海麦克林生化科技有限公司），均为分析纯；实验用水为Milli-Q超纯水（18.2 MΩ·cm）。

8-氧鸟嘌呤糖基化酶（OGG1）、10×NEB缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 1，4-二硫苏糖醇（DTT），pH 7.0）、100 × 牛血清白蛋白（10 mg/mL BSA）购于NEB 公司（New England Bioblabs 公司），尿嘧啶DNA 糖基化酶（UDG）、10 × 反应缓冲液（200 mol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.2）核糖核酸酶（RNase A）、实验所用DNA序列（表1）均购于上海生物工程股份有限公司。DNA 使用前在10 000 r/min 下离心5 min，然后用10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（含1 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制成100µmol/L DNA储备液，于-18 ℃冷冻保存。

表1 实验所用的DNA序列（5'-3'）Table 1 DNA sequences used in the experiment（5'-3'）

1.2 实验方法

1.2.1 DNA 杂交 取5µL 100µmol/L FAM-DNA1 溶液于离心管中，加入5µL 100µmol/L 含G 碱基且与FAM-DNA1 互补的DNA（c-DNA）溶液，用10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（含50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）定容至100 µL，充分混合。然后置于水浴中缓慢升温至95 ℃，保持10 min 后自然降至室温并孵育30 min，室温下避光培育过夜，使DNA 充分杂交。2 条单链DNA 序列互补，形成稳定的DNA 双链结构，将得到的FAM/dsDNA1 溶液储存于4 ℃的冰箱中备用。采用同法得到FAM/dsDNA2。

1.2.2 OGG1 的测定 取100µL FAM/dsDNA1 溶液于比色皿中，测定其荧光强度（F0），然后加入不同浓度的OGG1，反应溶液为1×NEB，300 g/mL BSA 的缓冲液，混匀后在40 ℃恒温水浴中反应2.5 h。待溶液冷却至室温后，设置荧光仪的激发波长为490 nm，狭缝宽度为5 nm，激发和发射光倍增管电压为700 V，在500 ～650 nm 范围内测定荧光发射光谱强度（F）。根据加入OGG1 前、后体系荧光强度的差值ΔF（ΔF=F-F0）测定OGG1的浓度。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

基于G碱基对荧光染料的猝灭效应以及OOG1对8-oxoG的识别和切除作用，以1条5'末端标记羧基荧光素且含有8-oxoG 的DNA 链为信号探针，1 条3'末端含多个G碱基的互补序列作为猝灭基团，当2 个链杂交后G 碱基末端会接近FAM，从而引发有效的光诱导电子转移，导致荧光猝灭。当体系中加入OGG1，其将受损G碱基剪切后DNA 序列产生缺口，较短的带有FAM 信号的DNA 片段由于熔化温度降低从互补链上解旋下来，释放出FAM 的荧光信号，导致体系荧光增强。根据加入OGG1 前、后体系的荧光强度变化可实现对OGG1的活性检测。检测的实验原理如图1所示。

图1 实验原理示意图Fig.1 Schematic diagram of the experimental principles

2.2 传感器的可行性

为验证方法的可行性，实验考察了加入OGG1 前、后反应体系的荧光光谱（如图2）。结果显示，FAM-DNA1具有很强的荧光信号，与c-DNA杂交后体系的荧光强度明显降低，说明形成双链DNA 后G 碱基和FAM之间产生PET效应，猝灭了FAM的荧光；当向底物中加入OGG1 后，荧光强度增强，且加入的OGG1 浓度越大，荧光信号增强越大。说明向猝灭体系中加入OGG1 后，由于酶对oxoG 碱基的识别切除作用，使得双链结构被破坏，熔化温度降低，释放出带FAM 的DNA片段，阻止了PET 过程，体系的荧光强度得到恢复。实验现象与设计的原理相一致。

图2 不同条件下FAM-DNA1的荧光光谱Fig.2 Fluorescent spectra of FAM-DNA1 in different conditions a：5 mmol/L FAM-DNA1；b：a+5 mmol/L c-DNA；c：b+10 U/mL OGG1；d：b+60 U/mL OGG1

为进一步验证体系荧光信号的升高是OGG1 剪切释放FAM-DNA 片段所致，以1 条相同序列的FAMDNA2 作为空白对照，在其它条件不变的情况下，考察其加入OGG1前、后体系的荧光信号变化（如图3）。结果表明，FAM-DNA2与c-DNA杂交后荧光信号同样被猝灭，当加入OGG1 后荧光强度无明显变化，说明双链结构未被破坏，不能产生荧光恢复。原因在于该体系中没有供OGG1 特异识别切除的oxoG，当加入OGG1 后，不会引起荧光信号的增强，进一步验证了实验原理是合理的。

图3 不同条件下FAM-DNA2的荧光光谱Fig.3 Fluorescent spectra of FAM-DNA2 in different conditions a：5 mmol/L FAM-DNA2；b：a+5 mmol/L c-DNA；c：b+60 U/mL OGG1

2.3 实验条件的优化

2.3.1 培育温度的优化 由于酶的活性与温度有密切关系，温度太低会使酶不能发挥最佳性能，温度过高会使酶失去活性。为得到最佳的培育温度，考察了加入酶后反应体系温度对荧光信号的影响。图4 为加入OGG1后不同温度时体系荧光强度的变化图。由图4 可知，当反应温度在30 ～35 ℃时，体系的荧光强度变化不明显，当温度达40 ℃时，体系的荧光强度变化明显增大，且继续升温时体系的荧光信号略有增加但变化不明显。考虑到实验效率，选择培育温度为40 ℃。

图4 不同培育温度对反应体系荧光强度的影响Fig.4 Effects of different incubation temperature on fluorescence intensity of the reaction system FAM/dsDNA1：5µmol/L；OGG1：40 U/mL

2.3.2 剪切时间的优化 剪切时间是一个非常重要的因素，影响着方法的灵敏度。考察了FAM/dsDNA1 体系与OGG1充分作用所需的时间。图5显示了酶剪切时间对体系荧光强度的影响。结果显示，在30 ～180 min 范围内，随着反应时间的延长，荧光强度差值不断增加，当达到150 min 后，变化趋于平缓，ΔF达到一个平台值，说明此时剪切反应已趋于完全。因此，实验选择最佳反应时间为150 min。

图5 加入OGG1后剪切时间对体系荧光强度的影响Fig.5 Effect of shear time on fluorescence intensity of the reaction system after addition of OGG1 FAM/dsDNA1：5µmol/L；OGG1：40 U/mL

2.4 线性范围与检出限

在优化的实验条件下，对方法灵敏度进行了评估。如上所述，当向FAM/dsDNA1 体系中加入OGG1 前后，体系的荧光强度发生改变，通过荧光强度的变化值实现对OGG1 的活性检测。向FAM/dsDNA1 体系中加入不同浓度OGG1，对荧光信号进行测定（如图6）。图6A 显示，随着OGG1 浓度从2 U/mL 增至1 000 U/mL，体系的荧光强度逐渐增强，表明OGG1 浓度越高，越多的FAM/dsDNA1 中的oxoG 受损碱基被切除，释放越多带FAM 信号的DNA片段，荧光增强变化越显著，说明荧光信号的增强高度依赖OGG1 的浓度。由图6B 可知，OGG1 的浓度（C，U/mL）在0 ～60 U/mL 范围内与体系荧光强度的变化值（ΔF）呈良好的线性关系，线性方程为：ΔF＝21.672 5C＋6.982 0，相关系数（r2）为0.993 2。根据3σ规则计算得到OGG1的检出限为0.7 U/mL。

图6 FAM/dsDNA1体系与不同浓度OGG1作用的荧光光谱（A），FAM/dsDNA1体系中加入不同浓度OGG1的线性曲线（B）Fig.6 Fluorescent spectra of FAM/dsDNA1 reaction system with different concentrations of OGG1（A），and linear curves of concentrations of OGG1 versus fluorescence intensity changes of FAM/dsDNA1 reaction systems（B）a：5µmol/L FAM-DNA1；b：a+5µmol/L c-DNA；OGG1（c-k）：2，10，20，40，60，80，100，500，1 000 U/mL

2.5 选择性

选择性是衡量检测方法优劣的重要指标，实验考察了其他蛋白质对FAM/dsDNA1 荧光信号的影响。以UDG酶和RNase A 作为干扰酶，将UDG酶、RNase A 和OGG1分别加入到FAM/dsDNA1 反应体系中，在FAM/dsDNA1为5 µmol/L，RNase A 为100 µg/mL，UDG 为100 U/mL，OGG1为40 U/mL条件下，检测相应的荧光强度变化。

结果显示，RNase A 和UDG 体系的荧光信号变化（ΔF）很小，而在OGG1 存在情况下，荧光强度变化很大，说明本方法可以高特异性地区分OGG1 与其他干扰蛋白，对OGG1检测有较好的选择性，在生物医学应用中具有很大的潜力。

2.6 抑制剂分析

Cd2+对许多酶存在抑制作用，常被选作酶抑制剂分析模型［13］。为研究OGG1抑制剂对OGG1酶活性的影响，选择硝酸镉Cd（NO3）2为抑制剂模型。OGG1的活性位点是通过Zn2+结合位点形成［14］，而Cd2+能够占据该活性位点使得OGG1 活性被抑制［15］。在FAM/dsDNA1 为5 µmol/L，OGG1 为60 U/mL 条件下，将5、10、20、30、50、80µmol/L的Cd2+与OGG1在40 ℃下培育20 min，然后加入到FAM/dsDNA1体系进行荧光强度检测。

基于公式（1）确定OGG1 被抑制的相对活性（RA）。根据RA与Cd2+浓度拟合的曲线确定最大半抑制浓度（IC50）。

RA=（Fi-F0）/（FCd-F0） （1）

其中，Fi为不存在Cd2+时的荧光强度；FCd为存在Cd2+时的荧光强度。结果表明，当Cd2+浓度从0 增至80µmol/L 时，OGG1的相对活性逐渐降低。根据拟合曲线确定在60 U/mL OGG1体系中，Cd2+抑制作用的IC50为22.26µmol/L。说明本方法可用于对OGG1酶活性的抑制作用研究。

2.7 血清样品中OGG1活性分析

采用本方法检测了正常人血清中OGG1的浓度。将血液样品在3 000 r/min下离心5 min，上层淡黄色液体即为待测的血清样品，-4 ℃冷藏备用。采用标准加入法，将不同浓度的OGG1加入正常人血清样品中，测定OGG1 的回收率。结果如表2 所示，OGG1 的回收率为99.1%～105%，相对标准偏差（RSD）为1.0%～4.3%。表明本方法可用于实际样品中OGG1的定量分析，在临床诊断中具有很大的应用潜力。

表2 人血清样品添加OGG1的回收率与相对标准偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of human serum samples added OGG1

3 结 论

本文基于脱氧鸟苷G 碱基的猝灭，设计了一种简单、灵敏的荧光方法用于DNA 糖基化酶OGG1 的检测。该方法具有明显的优势：探针设计简单，避免探针的复杂合成；其识别响应原理是高效的PET机制，且利用鸟嘌呤天然高效的荧光猝灭能力，无需使用有机染料分子标记的DNA 或额外的纳米材料作为猝灭剂，简化了实验步骤，节约了实验成本。方法不仅能提高OGG1 活性的分析效率，而且可为DNA损伤相关修复酶的检测提供简便、通用的传感平台，有望实现对肿瘤细胞中OGG1活性的检测。