CDK9、iASPP在子宫颈癌组织中的表达及临床意义

张雨强，骆婕，郭琴，赵曼丹，陶莹

（广东药科大学附属第一医院妇科，广东 广州 510030）

子宫颈癌（cervical cancer）是威胁全球妇女生命健康的主要恶性肿瘤之一。据报道：子宫颈癌在女性恶性肿瘤的发病率和死亡率中居世界第4位[1]，而中国的子宫颈癌发病率排第6位，死亡率排第8位[2]，且近年来子宫颈癌有逐步年轻化趋势。细胞周期蛋白依赖性激酶9（cyclin-dependent kinases 9，CDK9）是丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶家族成员之一[3]，其通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNA PolⅡ）上的羧基末端结构域（C-terminal domain，CTD），调节细胞基因转录过程[4]，从而调控肿瘤细胞的增殖及侵袭。p53凋亡刺激蛋白家族抑制成员（inhibitor of apoptosis-stimulating protein of p53,iASPP）为p53的抑制因子，不仅能够抑制p53诱导靶基因转录活化的作用，也能抑制p53促细胞凋亡的功能[5]，从而造成细胞异常增殖，最终导致肿瘤发生。目前，国内外对CDK9和iASPP的研究主要集中于卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、白血病等，关于两者在子宫颈癌中的研究较少。本文应用免疫组织化学方法检测CDK9和iASPP在不同子宫颈组织中的表达，分析CDK9、iASPP表达与子宫颈癌临床病理特征的关系。初步探讨CDK9、iASPP在子宫颈癌发生过程中的作用机制，进一步探讨CDK9、iASPP在子宫颈癌早期诊断和临床预后评估中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择来自广东药科大学附属第一医院2016年9月至2020年9年行手术治疗或活检确诊的124位患者，其中癌症组（子宫颈癌患者45位）、高级别组（子宫颈高级别鳞状上皮内病变患者40位）和低级别组（子宫颈低级别鳞状上皮内病变组织39位），另选择21位同期因“子宫平滑肌瘤”行全子宫切除术，术后病理是正常子宫颈组织的患者为对照组。所有入选病例均经病理诊断，术前或活检前均未进行药物、化学、放射和激光等治疗。其中，根据FIGO 2018年子宫颈癌分期标准，45例子宫颈癌患者的临床分期在ⅠA-ⅣB期。

1.2 实验试剂与方法

兔抗人CDK9多克隆抗体（BC001968，1∶200）、兔抗人iASPP多克隆抗体（BC064913，1∶800）购自美国Proteintech公司；通用型SP免疫组化染色试剂盒为北京中杉生物技术公司产品。标本用福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm，脱蜡、水化，修复抗原，滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS溶液洗涤，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB显色，复染，密封，镜检。

1.3 结果判断

CDK9表达定位于细胞核，表现为黄色或棕黄色。iASPP表达定位于细胞核和（或）细胞质，表现为黄色或棕黄色。CDK9和iASPP根据染色强度（无着色为0，淡黄色为1，黄色为2，棕黄色为3）和阳性细胞百分比（＜5%为0，5%～25%为1，26%～50%为2，51%～75%为3，＞75%为4）分别计分，将两种评分相乘即为免疫组织化学结果最后得分。得分范围为0～12分，其中0分为阴性（-），1～3分为弱阳性（+），4～8分为中度阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。阳性表达结果包括（+）及其以上者。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0进行统计学处理，运用单因素方差分析或Mann-WhitneyU秩和检验进行组间比较；采用卡方检验检测CDK9和iASPP表达与子宫颈癌临床病理特征的关系；通过Spearman等级相关分析子宫颈癌组织中CDK9和iASPP的表达相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDK9、iASPP在各组子宫颈组织中的表达

细胞核内见棕黄色为CDK9阳性表达，细胞核内未见棕黄色为CDK9阴性表达，见图1。CDK9在对照组、低级别组、高级别组、癌症组中的阳性表达率分别为19.4%、43.6%、55.0%、68.9%，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。细胞核和（或）细胞质内见棕黄色为iASPP阳性表达，细胞核和（或）细胞质内未见棕黄色为iASPP阴性表达，见图2。对照组、低级别组、高级别组、癌症组中CDK9的阳性表达率分别为28.6%、51.3%、65.0%、73.3%，各组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1 免疫组化检查CDK9在各组子宫颈组织中的表达（400×）Figure 1 Immunohistochemical examination of the expression of CDK9in cervical tissues of different groups（400×）

表1 CDK9、iASPP在各组子宫颈组织中的表达Table 1 Expression of CDK9 and iASPP in cervical tissues of different groups

图2 免疫组化检查iASPP在各组子宫颈组织中的表达（400×）Figure 2 Immunohistochemical expression of iASPP in cervical tissues of different groups（400×）

2.2 CDK9、iASPP表达与子宫颈癌临床病理特征的关系

子宫颈癌组织中，按照浸润深度分组，浸润深度＜1/2有24例，CDK9的阳性率为54.2%，iASPP的阳性率为58.3%；浸润深度＞1/2有21例，CDK9的阳性率为85.7%，iASPP的阳性率为90.5%，两组比较差异有统计学意义（χ2=5.201，P=0.023；χ2=5.917，P=0.015）。按照淋巴结转移情况，23例发生淋巴结转移，CDK9阳性率为47.8%，iASPP阳性率为52.2%；22例无淋巴结转移，CDK9阳性率为90.9%，iASPP的阳性率为95.5%，两组间比较差异有统计学意义（χ2=9.738，P=0.002；χ2=10.771，P=0.001）。CDK9和iASPP表达与患者临床分期、分化程度、脉管浸润等均无相关性（P＞0.05）。见表2。

2.3 CDK9与iASPP在子宫颈癌组织中的表达相关性

与14例CDK9阴性表达的子宫颈癌组织相比，在31例CDK9阳性表达的子宫颈癌组织中，iASPP的阳性表达率更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步运用Spearman等级相关分析癌症组的实验数据，结果显示：CDK9和iASPP癌症组中的表达相关性为正相关，表明CDK9和iASPP在子宫颈癌的发生发展过程中可能起着协同作用（P＜0.05）。见表3。

表3 CDK9和iASPP在子宫颈癌中的表达相关性Table 3 Correlation between the expression of CDK9 and iASPP in cervical carcinoma

3 讨论

周期依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）是酵母中发现的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶家族，具有调节细胞周期和细胞DNA转录的功能[6-7]。CDKs的激活在正常细胞中受到严格控制，以维持体内细胞的平衡，当CDKs失去控制后会导致细胞异常增殖和癌症进展。近年来的国内外研究表明，CDKs在许多肿瘤中都过度表达，并参与肿瘤细胞的生长、分化、迁移、侵袭和凋亡[8-10]。因此，CDKs逐渐成为人类治疗癌症的新靶点，而主要参与基因转录和细胞周期调节的CDK9被认为是最重要的一个。CDK9与细胞周期蛋白T1（cyclins T1）结合形成复合物，复合物中包括正相转录延伸因子 b（positive transcription elongation factor b,P-TEFb），P-TEFb可以磷酸化RNA聚合酶Ⅱ的羧基末端结构域，从而促进前mRNA转录物的延伸[11]，造成细胞增殖失控。多项研究证明CDK9在多种肿瘤的发生发展中起着重要作用，其中包括卵巢癌、儿童软组织肉瘤、黑色素瘤、白血病、胰腺癌、肝癌、子宫内膜癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌[12-14]。然而CDK9在子宫颈癌中的生物学行为还处于未知状态，CDK9在子宫颈癌中的靶向治疗潜力也仍不清楚。

本研究结果表明：CDK9在对照组、低级别组、高级别组、癌症组中的阳性率分别为19.4%、43.6%、55.0%、68.9%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示CDK9的过度表达参与子宫颈癌的早期形成，最终导致子宫颈癌的发生。CDK9在卵巢癌、子宫内膜癌和骨肉瘤中也有类似表现。Parvathareddy等[13]发现在441例卵巢癌组织中有56.2%CDK9过度表达，CDK9过度表达与部分卵巢癌临床病理特征显著相关，如远处转移、Ⅳ期肿瘤、肿瘤复发和Ki-67指数高，且远处转移的卵巢癌组织中CDK9过度表达的发生率显著高于原发卵巢癌组织。He等[12]通过免疫组织化学方法检测了32例子宫内膜癌组织中CDK9的表达情况，其中40.6%的子宫内膜癌组织中CDK9高表达，原发子宫内膜癌组织中的CDK9表达水平显著低于转移和复发的子宫内膜癌组织。Ma等[15]在70例骨肉瘤组织中检测出67例（95.7%）肿瘤组织CDK9表达阳性，转移的骨肉瘤组织中CDK9表达显著升高，且CDK9低表达肿瘤患者的总体生存率明显高于CDK9高表达肿瘤患者。Ajiro等[16]发现抑制CDK9不仅可以抑制HPV的复制和HPV E6及E7蛋白的表达，还可以恢复P53的抑癌功能，且进一步的研究发现在SIL人源性肿瘤异种移植（patient-derived xenografts，PDX）的小鼠模型上，抑制CDK9可以抑制HPV 18诱导的异型增生和过度增殖，同时也降低HPV的病毒载量。综上所述，CDK9参与多种肿瘤的发生、发展过程，包括子宫颈癌，且CDK9抑制剂在未来可能临床应用在子宫颈癌的治疗上。

p53是一种与肿瘤高度相关的抑癌基因，不仅能抑制细胞增殖，也能促进细胞凋亡[17]。p53凋亡刺激蛋白（apoptosis stimulating proteins of p53,ASPP）家族是一组具有高度结构同源性的蛋白质家族[18]，能和p53特异性结合，增强或减弱p53促凋亡基因的启动活性，从而对依赖p53的细胞凋亡通路进行调控，控制细胞的凋亡[19]。ASPP家族由3个成员组成：ASPP1、ASPP2和 iASPP，其中 ASPP1和ASPP2是p53基因的激活剂，能特异性激活p53基因的促细胞凋亡的能力[20]。iASPP为p53基因的抑制剂，特异性抑制p53基因诱导目的基因转录活化和促细胞凋亡功能，导致肿瘤的发生[21-22]。因此，iASPP又被称为是一种新的癌基因。此外，iASPP还能增加造血干细胞的数量和重建能力，保护受损细胞不发生细胞凋亡，导致受损细胞具有向恶性细胞转化的能力[23]。也有研究表明过度表达的iASPP在绒毛膜癌中可能通过自噬作用调节癌细胞的生长，抑制自噬作用可增加机体对氧化应激的敏感性[24]。大量的研究表明，iASPP在子宫颈癌组织中呈过度表达状态，提示过度表达的iASPP很可能通过抑制细胞凋亡的过程，导致子宫颈癌的形成，并且与子宫颈癌患者的耐药性和不良预后有关[25]。

本研究结果显示，iASPP在对照组、低级别组、高级别组及癌症组中的阳性表达率分别为28.6%、51.3%、65.0%、73.3%。随着子宫颈病变的加重，iASPP的阳性表达也逐渐增加，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与此相同的是，Wu等[25]通过免疫组织化学方法和Western blot方法检测了iASPP在112位子宫颈癌患者的癌组织和癌旁子宫颈组织中的表达情况，结果显示子宫颈癌组织中iASPP的阳性表达显著高于癌旁子宫颈组织。另一项研究表明，子宫颈癌细胞中的iASPP mRNA也显著高于正常子宫颈细胞，且细胞核iASPP高表达与放化疗抵抗相关[26]。也有研究表明当子宫颈癌细胞中的iASPP被敲低表达后，子宫颈癌细胞的生长增殖减慢及侵袭力降低[27]。综上所述，iASPP可能以多种方式、多种机制参与子宫颈癌的发生和发展，且iASPP有望成为子宫颈癌药物治疗的新靶点

为了明确CDK9与iASPP表达与子宫颈癌临床预后的关系，本研究分析了CDK9和iASPP表达与子宫颈癌临床病理特征的相关性。结果显示：CDK9和iASPP表达与临床分期、浸润深度、淋巴结转移等子宫颈癌临床病理特征相关（P＜0.05），而与分化程度和脉管浸润等子宫颈癌临床病理特征无关（P＞0.05）。以上结果说明CDK9和iASPP高表达的子宫颈癌患者相比于CDK9和iASPP低表达的子宫颈癌患者，处于过度增殖状态的子宫颈癌细胞更具有侵袭转移能力。同时，当子宫颈癌的分期越高，CDK9和iASPP的阳性表达率也越高。为了进一步明确CDK9与iASPP在子宫颈癌发展侵袭中的相关性，本研究通过Spearman等级相关分析发现：在子宫颈癌组织中CDK9和iASPP表达的相关性为正相关，表明CDK9和iASPP在子宫颈癌的发展侵袭过程中具有协同作用，两者的过度表达共同促进子宫颈癌细胞异常增殖，进而促进子宫颈癌的发展侵袭。癌症基因组图谱数据库（the cancer genome atlas,TCGA）的一项结肠癌队列研究中，发现结肠癌细胞系中的iASPP mRNA水平与CDK9 mRNA水平呈正相关，支持CDK9在促进iASPP转录激活中发挥作用的观点。此外，Wu等[28]发现抑制CDK9可以在转录水平降低iASPP，从而重新激活p53的抑癌功能，提出了CDK9-iASPP-p53生物轴的概念，但CDK9通过何种信号通路作用于iASPP未被提及，CDK9、iASPP之间的相关机制仍不清楚。本研究证实了在子宫颈癌组织中CDK9和iASPP具有正相关的关系，从侧面验证了CDK9-iASPP生物轴的存在。

综上所述，子宫颈组织中CDK9与iASPP的表达高低与子宫颈病变程度关系密切，CDK9与iASPP在子宫颈癌发生发展过程中具有协同作用。虽然CDK9和iASPP在子宫颈癌中的作用机制尚不明确，仍有待于更多的实验和研究进一步明确CDK9和iASPP的作用机制，但CDK9和iASPP在未来有望成为治疗子宫颈癌的潜在药物靶点，以及成为临床上评估子宫颈癌患者预后的有价值检测指标。同时，对CDK9和iASPP的研究也为子宫颈癌的靶向药物治疗起到积极的推动作用。