响应面法优化紫丁香叶总黄酮超声提取工艺

李菁，杜少兵 ，杨蕾 ，周慧慧 ，孟祎 ，薛志鹏，王小平 ，2，白吉庆 ，2

（1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西省中药原料质量监测技术服务中心，陕西 咸阳 712046）

紫丁香SyringaoblateLindl.是木犀科丁香属多年生灌木或小乔木[1]，具有清热解毒、利湿退黄的功效[2]，用于治疗急性泻痢、黄疸型肝炎、火眼、疮疡等[3-4]。现代研究表明，紫丁香叶中含有黄酮类、苯丙素类、三萜类、环烯醚萜类等多种化学成分[3-8]，其中黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗微生物、抗炎镇痛、保肝降血脂等多种药理活性[9-11]。响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，可全面考察各因素之间的交互作用，改善正交试验设计中精度与预测性较差等不足[12]。由于黄酮类成分具有多种生物活性，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业[13]，开发应用前景较广，而关于紫丁香叶总黄酮的研究报道较少，因此，本研究采用响应面法优化紫丁香叶总黄酮的超声提取工艺，拟为紫丁香叶总黄酮的高效提取及后续的开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-6100 DOUBLE BEAM紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；KQ-300VDE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；十万分之一电子分析天平（瑞士MettlerToledo公司，精度：0.01 mg，量程：81 g/220 g～0.01 g/0.1 mg）；DHG-9075A干燥箱（上海恒科有限公司）；LG-01高速中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试剂与药物

紫丁香叶采自陕西省富县，经陕西中医药大学白吉庆教授鉴定为木犀科丁香属紫丁香Syringa oblataLindl.的干燥叶（标本存放于陕西中医药大学中药资源普查样本储藏室，标本号：20200412LY）；芦丁对照品（纯度≥92.5%，批号10080-200707，中国药品生物制品检定所）；无水乙醇、Al（NO3）3、NaOH、NaNO2（天津市天力化学试剂有限公司）均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮质量分数测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的制备 取芦丁4.60 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加适量95%（体积分数，下同）的乙醇溶解后定容，即得0.18 mg/mL的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称定一定量的紫丁香叶粉末（过二号筛），按照料液比（g∶mL）1∶20加入55%（体积分数，下同）乙醇，按照超声波功率为90W、频率为45 kHz超声50 min，提取2次，合并2次续滤液并定容，即得。

2.1.3 检测波长的选择 精密吸取供试品溶液、对照品溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO2溶液1 mL，混匀，放置6 min，再加入10%Al（NO3）31 mL，混匀，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用相应溶剂定容，混匀，放置15 min。以相应试剂作为空白，在波长为400～800 nm范围进行测定，结果显示上述2种溶液在505 nm处均有最大吸收，故选择检测波长为505 nm。

2.1.4 标准曲线的制备 分别精密吸取上述对照品溶液 0、1、2、3、4、5 mL，置于 25 mL 量瓶中，按“2.1.3”项方法进行显色，在505 nm处测定吸光度。将芦丁质量浓度（mg/mL）设为横坐标、吸光度设为纵坐标，线性回归，得回归方程y=10.784x+0.008（r=0.999 5），表明在0.000～0.092 mg/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“2.1.3”项方法进行显色，在505 nm处测定，连续测定6次，结果测得吸光度的RSD值为0.01%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 精密称定样品粉末，按“2.1.2”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.3”项方法进行显色，在505 nm处测定吸光度计算总黄酮质量分数，结果显示总黄酮质量分数为（107.43±1.31）mg/g，RSD值为0.75%，表明方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1.3”项方法进行显色，分别于0、1、2、4、6、8、12 h在505 nm处测定吸光度，结果显示吸光度的RSD值为2.14%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取总黄酮质量分数已知的样品1 g，精密称定6份，分别加入对照品0.05 g，按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项方法进行显色，在505 nm测定吸光度，计算加样回收率，结果显示平均加样回收率为（98.07±1.46）%，其RSD为1.49%，见表1，表明方法的加样回收率符合要求。

表1 总黄酮加样回收率试验结果Table 1 The recovery results of total flavonoids

2.2 单因素试验

根据文献报道和预实验结果，分别考察料液比、提取时间、乙醇体积分数、超声温度、提取次数对紫丁香叶总黄酮质量分数的影响。

2.2.1 料液比 取样品粉末1 g，精密称定，按照料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，分别加入体积分数为55%的乙醇溶液，温度设定50℃，超声处理50 min，超声波功率为90 W、频率为45 kHz，提取1次，测定吸光度计算总黄酮质量分数，结果见图1。可见，料液比（g∶mL）为1∶20时，总黄酮质量分数最多；料液比大于1∶40时，总黄酮质量分数无显著性差异，为节约溶剂，故选定料液比（g∶mL）为1∶20。

图1 不同料液比对总黄酮质量分数的影响Figure 1 Effect of different material liquid ratio on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.2 乙醇体积分数 取样品粉末1 g，精密称定，按照料液比为1∶20，分别加入25%、35%、45%、55%、65%、75%的乙醇，50℃、超声波功率为90W、频率为45 kHz超声提取50 min，提取1次，测定吸光度计算总黄酮质量分数，结果见图2。可见，乙醇体积分数为55%时总黄酮质量分数最多，故选定乙醇体积分数为55%。

图2 不同乙醇体积分数对总黄酮质量分数的影响Figure 2 Effect of different ethanol volume fraction on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.3 提取时间 取样品粉末1 g，精密称定，加入体积分数为55%的乙醇20 mL，50℃分别超声提取10、20、30、40、50、60 min，测定吸光度计算总黄酮质量分数，结果见图3。可见，提取时间50 min时总黄酮质量分数最多，故选定提取时间为50 min。

图3 不同超声时间对总黄酮质量分数的影响Figure 3 Effect of different extraction time on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.4 超声温度 取样品粉末1 g，精密称定，加入体积分数为55%的乙醇溶液20 mL，分别于温度20、30、40、50、60 ℃进行超声提取50 min，测定吸光度计算总黄酮质量分数，结果见图4。可见，超声温度为50℃时总黄酮质量分数最多，故选定超声温度为50℃。

图4 不同超声温度对总黄酮质量分数的影响Figure 4 Effect of different ultrasonic temperature on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.5 提取次数 取样品粉末1 g，精密称定，加入体积分数为55%的乙醇溶液20 mL，50℃分别超声提取1、2、3次，50 min/次，测定吸光度计算总黄酮质量分数，结果见图5。可见，提取次数为2次时总黄酮质量分数最多，故选定提取次数为2次。

图5 不同提取次数对总黄酮质量分数的影响Figure 5 Effect of different extraction times on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.3 响应面法优化提取工艺

2.3.1 响应面法实验设计 通过单因素试验，初步确定料液比（g∶mL）为1∶20，乙醇体积分数为55%，提取时间50 min，超声温度50℃，提取2次较为合适，在单因素试验筛选的基础上结合耗能等因素，以料液比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）为影响因素，总黄酮质量分数为评价指标，采用Design-Expert 11软件，根据Box-Behnken设计原理，进行3因素3水平17个实验点Box-Behnken设计-响应面分析实验。因素水平见表2，试验结果见表3。

表2 响应面因素水平表Table 2 Coding table of response surface factor level

表3 响应面试验设计与试验结果Table 3 Design and results of response surface test

2.3.2 数学模型的建立及分析 使用Design Expert软件进行拟合，得到的回归方程如下：Y=107.15+3.62A-2.81B-2.14C-2.31AB+0.7075AC-0.3625BC-20.30A2-8.92B2-8.15C2，R2=0.9891，与 1 接近，说明通过二次回归得到的综合评分模型与试验拟合较好。方差分析结果见表4。

表4 回归模型方差分析结果Table 4 The results of variance analysis of regression model

由表4可知，模型极显著（F=70.82，P＜0.0001），失拟项不显著（P=0.1381＞0.05），说明此模型有统计学意义。各因素对紫丁香叶总黄酮质量分数的影响由大到小的顺序为A＞B＞C，即料液比＞乙醇体积分数＞提取时间，其中二次项A2、B2、C2的影响极显著（P＜0.01），可利用此模型来分析和预测紫丁香叶中的总黄酮质量分数。

2.3.3 响应面交互作用分析 用Design Expert 11软件绘制的各因素交互作用的曲面图与等高线图，可直观地反映各因素间的交互作用对响应值的影响程度，响应面图的坡度越陡表示两个因素之间交互作用越大，等高线图为椭圆时表示两因素交互作用显著[14-17]。由图6可知，料液比与乙醇体积分数之间的曲线最陡峭、提取时间次之，乙醇体积分数与提取时间的等高线图最圆，说明料液比与乙醇体积分数之间的交互作用对响应值（总黄酮质量分数）的影响最显著，乙醇体积分数与提取时间之间的交互作用对响应值（总黄酮质量分数）的影响最不显著，与表4中 AB（F=4.89，P=0.062 7）＞AC（F=0.457 4，P=0.520 6）＞BC（F=0.120 1，P=0.739 1）相对应。

图6 各因素交互作用的曲面图与等高线图Figure 6 Surface and contour plots of the interaction of various factors

2.3.4 验证试验 通过Design Expert 11软件计算得出最优提取工艺为：料液比（g∶mL）1∶20.964、乙醇体积分数53.322%、提取时间48.769 min，预测总黄酮质量分数为107.692 mg/g。考虑到实际实验的可操作性，将优化条件修正为料液比（g∶mL）1∶20、乙醇体积分数55%、提取时间50 min，紫丁香叶总黄酮质量分数为（106.50±1.21）mg/g（n=3），与预测值107.69 mg/g接近，表明方法稳定可行。

3 讨论

植物中总黄酮的提取方法有回流提取法、热浸提法、超声提取法、微波萃取提取法等[18-19]，超声波提取可利用超声波的空化作用增加溶剂穿透能力，有效破坏组织的细胞壁，促进总黄酮释放到溶剂中从而提高提取率，提取率相对较高且节能环保[20-21]。常用的优化提取工艺的方法有响应面法、正交试验法、均匀设计法等，均匀设计用于水平数较多且各因素水平数不等的情况[14]，响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化方法，可全面考察各因素之间的交互作用，改善正交试验设计中精度与预测性较差等不足[12]。因此本研究采用响应面法优化紫丁香叶总黄酮超声提取工艺。

单因素试验中，分别考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间、超声温度、提取次数5个因素对于总黄酮质量分数的影响，由于超声过程中仪器自身发热会对超声温度产生一定的影响，因此选择以料液比、乙醇体积分数、提取时间为影响因素，总黄酮质量分数为评价指标，进一步优化紫丁香叶总黄酮提取工艺，得到最佳工艺为：料液比为1∶20（g∶mL）、乙醇体积分数55%、提取时间50 min，验证实验与预测值相接近，说明响应面法优化超声提取工艺的结果准确可靠，为紫丁香叶总黄酮的资源开发利用提供实验依据。