基于化学成分变化对炆远志“减毒”效应研究

丁平平 ，易斌 ，陈华师 ，陈明霞，4，吕尚 ，2，张青 ，陈西勇，饶毅 ，2

（1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330000；3.江西建昌帮药业有限公司，江西 抚州 344000；4.北京斯利安药业有限公司，北京 100176）

远志为远志科植物远志（PolygalatenuifoliaWilld.）的干燥根，主要含有三萜皂苷类、寡糖酯类、酮类成分[1-2]。其中远志皂苷类成分包括远志皂苷A、B、C、D等多种原型皂苷，经高温炮制后水解成具有相同母核的细叶远志皂苷和远志酸（见图1）。远志既具有安神益智、祛痰、消肿的作用，同时还对胃肠道有刺激性[3-4]。文献研究表明，远志经蜜炙后远志皂苷B的含量下降，从而降低了胃肠道毒性，因此可将远志进行炮制以降低胃肠道毒性[5-6]。历代医方本草对远志的炮制方法记载众多，甘草制远志习称制远志，首载于《雷公炮炙论》，是目前临床应用最多的炮制品，为2020年版《中国药典》所收载。炆法炮制为江西建昌帮药业有限公司独门炮制技艺，经考证最早出自明朝缪希雍《炮炙大法》，早在东晋葛洪已有应用，具有“工具辅料独特，工艺取法烹饪，讲究形色气味，毒性低疗效高”的炮制风格，在赣闽地区广为流传，代表饮片有炆熟地、炆黄精、炆远志等[7-8]。目前，未见炆远志化学成分与毒性关系的研究报道。

图1 远志中的皂苷类成分结构式Figure 1 Structural formula of saponins in P.tenuifolia

本文以炆远志为研究样品，与生远志、制远志进行对比研究，选用远志原型皂苷类成分中含量较高的远志皂苷B为代表，以及远志酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖酯、细叶远志皂苷、远志酸为检测指标，分析远志炆制过程各成分之间的变化规律；并针对具有毒性的远志皂苷B变化情况，采用小鼠小肠上皮隐窝细胞（IEC-6细胞）为模型，以IC50和可间接反应机体组织细胞受氧自由基攻击的严重程度的丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）为指标[9-12]，比较3者对胃肠道的毒性，研究炆远志化学成分变化与毒性之间的关系。

1 材料与仪器

1.1 材料

远志药材：批号 Y068-201204、Y068-201206、Y068-201210，由江西建昌帮药业有限公司提供，经江西中医药大学付小梅教授鉴定为远志科植物远志（PolygalatenuifoliaWilld.）的干燥根。

小鼠小肠上皮隐窝细胞系（IEC-6细胞），购自中乔新舟生物公司。

DMEM高糖培养基（Solarbio，批号：12100）；胎牛血清（ExCell Bio，批号：FSP500）；PBS磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2-7.4，Solarbio，批号：P1020）；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio，批号：T1300）；二甲亚砜（DMSO，POWER CELL，批号：O1028A）；Cell Counting Kit-8（meilunbio，批号：MA0218-3-Mar-05G）。丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号：A003-1-2）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒（批号：A006-2-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号：A001-3-2）均购自南京建成生物工程研究所。3，6′-二芥子酰基蔗糖酯（批号：20021903，纯度≧98.0%）、远志酮Ⅲ（批号：YRY144-200401，纯度≧98.0%）、细叶远志皂苷（批号：PS000954，纯度≧98.0%）、远志皂苷B（批号：35906-36-6，纯度≧98.0%）、远志酸（批号：110796-201922，纯度＞99.2%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AB104-N万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AUW2200十万分之一电子分析天平（日本岛津公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；恒温电热套（常州国华公司）；SpectraMax I3多功能酶标仪（MD，USA美国）；BA410生物显微镜（厦门Motic公司）；二氧化碳恒温培养箱（NAPCO）。

2 方法

2.1 炮制品的制备

生远志：取远志药材，洗净，去除远志木质心，

2.2 远志酮Ⅲ、3，6′-二芥子酰基蔗糖酯和细叶远志皂苷的含量测定

采用2020年版《中国药典》“远志”项下的方法。

2.3 远志皂苷B、远志酸的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；以乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min,85%～75%B;5～10 min,75%～65%B;10～50 min,65%～53%B）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30℃。

2.3.2 对照品溶液的制备 取远志皂苷B、远志酸对照品适量，精密称定，分别加70%（体积分数，下同）甲醇制成每1 mL含1 mg远志皂苷B、0.2 mg远志酸的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 取生远志（Y068-201204、Y068-201206、Y068-201210）按“2.1”项下炆远志炮制工艺进行炮制，分别于炆制过程中的不同时间点进行取样。精密称取各远志样品粉末约0.5 g，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，过滤即可。

2.3.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µL，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.4 细胞毒性试验

称取生远志、制远志及炆远志，精密加入70%甲醇提取2次，减压浓缩回收溶剂后，真空干燥制得干膏。分别精确称定生远志、制远志及炆远志干膏加入适量DMSO溶解，制成质量浓度为30 mg/mL（按饮片计）母液。远志皂苷B用DMSO溶解，制成10 mg/mL的母液，实验时再以含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液（以下简称为完全培养基）进行等比例稀释，得各所需浓度稀释液，用于小鼠小肠上皮隐窝IEC-6细胞毒性试验。

2.4.1 CCK-8测定细胞抑制率 将小鼠小肠上皮隐60℃烘箱鼓风干燥，即可。

制远志：参照2020年版《中国药典》项下方法炮制。取甘草，加适量水煎汤，去渣，加入净远志，用文火煮至汤吸尽，取出，干燥，即得制远志[3]。

炆远志：取净远志和甘草，一同放入炆药罐内，加入温水（45～50℃）适量，上盖，将罐移至围灶内，堆放干糠于四周，点火加热，炆制16 h，至罐内汁水吸尽，取出，筛去甘草，65℃干燥至半干后，取出拌入药汁，待药汁吸尽后继续干燥，即得炆远志[13]。该炮制方法由江西建昌帮药业提供。窝细胞IEC-6在含10%FBS的高糖DMEM中于37℃、5%CO2培养箱中进行常规培养。试验分为对照组（含有细胞的未给药组）、空白组（不含细胞的未给药组）、不同炮制工艺的远志样品组和远志皂苷B组。参照文献[12-15]，取对数生长期的IEC-6细胞，调整细胞密度为 5×105个/mL，每孔 100 μL接种于96孔板中，置于恒温培养箱中培养，隔天取出，弃去上清液，分别于细胞中加入以上稀释至不同浓度的生远志、制远志、炆远志及远志皂苷B单体药液，每个浓度6个复孔；同时设置未加药液的对照组。将处理好的细胞置于CO2培养箱中培育24 h。取出，分别加入CCK-8试剂200 μL，继续培养1 h后停止，在450 nm波长处进行测定，计算细胞抑制率及IC50值。

2.4.2 细胞中MDA、SOD、GSH的测定 根据细胞抑制试验结果，分别设置生远志、制远志、炆远志及远志皂苷B单体的高、中、低3个浓度组及对照组（含有细胞的未给药组）、空白组（不含细胞的未给药组）。取对数生长期的IEC-6细胞，调整细胞密度为1.2×106个/mL，每孔2 mL接种于6孔板中，置于5%CO2恒温培养箱中培养。隔天取出，弃去上清液，加入预配置的样品溶液，同时设置对照组，每组6个复孔，将处理好的细胞置于CO2培养箱中培育24 h。将培养好的细胞，根据试剂盒说明书进行样品前处理及MDA、GSH、SOD的测定[5-7]。

3 结果及讨论

3.1 远志炆制过程及远志不同炮制品的含量测定

远志皂苷B、远志酸的含量测定方法学考察结果显示，远志皂苷B及远志酸的线性回归方程分别为y=2 793.80x+22 348.71、y=4 662.78x+2 830.06，线性范围分别为 15.47～494.90 μg/mL、6.31～201.88 μg/mL，相关系数分别为0.997 6、0.999 6。精密度试验RSD值分别为0.13%、2.99%（n=6），稳定性试验RSD 值分别为 1.32%、0.83%（n=6），重现性试验RSD值分别为0.81%、1.18%，平均加样回收率分别为98.97%和98.55%、RSD值分别为0.93%和1.21%。以上结果表明远志皂苷B、远志酸含量测定方法可行，符合要求。

对3批次炆远志炮制过程中的5个成分的变化进行检测，并与制远志进行比较。结果见表1、图2-4。

图2 生品及不同炮制品中远志酮Ⅲ及3，6-二芥子酰基蔗糖酯含量测定HPLC图谱Figure 2 Chromatogram of determination of polyxanthoneⅢand 3，6-dicarinoacyl sucrose ester in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

图3 生品及不同炮制品中远志皂苷B及远志酸含量测定HPLC图谱Figure 3 Chromatogram of determination of polygenin B and polygenic acid in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

图4 生品及不同炮制品中细叶远志皂苷含量测定HPLC图谱Figure 4 Chromatogram determination of polygala saponin in crude P.tenuifolia and different processed product by HPLC

表1 5种化学成分的含量测定结果Table 1 Content determination of five chemical compositions（n=3） w/%

3.2 细胞抑制率试验

通过体外培养小鼠小肠上皮隐窝细胞IEC-6，以抑制率和IC50为指标，考察生远志、制远志、炆远志及远志皂苷B单体在不同浓度下的细胞毒作用，见表2。结果表明，各组药物都显示出了明显的细胞毒作用，且呈明显剂量依赖关系；但在同一浓度下，制远志的细胞抑制率小于生远志，差异有统计学意义（P＜0.05），炆远志的细胞抑制率明显低于生远志和制远志，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；同时，生远志、制远志、炆远志及远志皂苷B单体的IC50值依次为0.423、0.699、1.386、0.039 mg/mL。综合抑制率和IC50值可以看出，3种远志对细胞的毒性顺序为生远志＞制远志＞炆远志。

表2 生远志、炆远志、制远志及远志皂苷B的细胞抑制率Table 2 Inhibition rate of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on cells(±s,n=6)

表2 生远志、炆远志、制远志及远志皂苷B的细胞抑制率Table 2 Inhibition rate of crude P.tenuifolia,stewed P.tenuifolia,processed P.tenuifolia and polygala saponin B on cells(±s,n=6)

与生远志各浓度组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与制远志各浓度组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别生远志ρ/（mg·mL-1）2 1 IC50/（mg·mL-1）0.423 95%的可信区间0.357～0.501 0.5 0.25 0.125 0.062 5制远志2 1 0.6990.610～0.803 0.5 0.25 0.125 0.062 5炆远志2 1 1.3861.317～1.431远志皂苷B 0.5 0.25 0.125 0.062 5 0.632 0.326 0.161 0.083 0.044 0.022细胞抑制率/%99.577±1.860 79.983±1.450 66.071±0.983 51.864±0.731 35.995±0.820 18.295±0.601 99.851±1.415 83.700±1.050*68.330±0.713*49.641±0.571*34.478±0.840*24.070±0.451**80.195±1.755**▲▲65.337±0.880**▲▲54.230±0.753*▲▲44.559±0.881**▲▲34.532±0.460 22.152±0.803**▲97.521±1.420 87.070±1.150**▲70.517±1.283**65.641±0.811**▲▲51.842±1.680**▲▲41.251±0.851**▲▲0.0390.031～0.049

采用在远志原型皂苷中含量相对较高的远志皂苷B进行比较。生远志中含有与远志皂苷B为代表的原型远志皂苷含量较高，IC50值最小，毒性最大。而炆远志中含有的远志皂苷B含量最少，IC50值最大，毒性较小。

3.3 MDA、GSH、SOD指标的测定

据文献报道，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）的含量高低可间接反应机体组织细胞受氧自由基攻击的严重程度，即MDA的值越大，SOD及GSH的值越小，毒性越大[9-11]。因此选择MDA、SOD、GSH进行测定，来进一步探讨炆制“减毒”的原因。

从表3可见：与对照组比较，生远志、制远志、炆远志的各组细胞GSH和SOD的含量明显降低（P＜0.01），MDA含量明显增加（P＜0.01）；与生远志组比较，制远志和炆远志各组的GSH及SOD的含量均显著增加（P＜0.01），MDA 的含量显著降低（P＜0.01），说明生远志经过炮制后的制远志、炆远志毒性显著降低；与制远志进行比较，炆远志各档次浓度组的GSH及SOD的含量均显著增加（P＜0.01），MDA的含量显著降低（P＜0.01），说明炆远志毒性与制远志比较显著降低；远志皂苷B单体对MDA、SOD、GSH的含量变化与生远志、炆远志和制远志的变化相反，证明其具有较强的胃肠道毒性。

表3 生远志、炆远志、制远志及远志皂苷B对GSH、SOD、MDA的影响Table 3 Effects of crude P.tenuifolia，stewed P.tenuifolia，processed P.tenuifolia and polygala saponin B on GSH，SOD and MDA(±s,n=6)

表3 生远志、炆远志、制远志及远志皂苷B对GSH、SOD、MDA的影响Table 3 Effects of crude P.tenuifolia，stewed P.tenuifolia，processed P.tenuifolia and polygala saponin B on GSH，SOD and MDA(±s,n=6)

与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与生远志各浓度组比较：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与制远志各浓度组比较：■P＜0.05，■■P＜0.01。

组别对照生远志ρ/（mg·mL-1）0 2 1 0.5制远志2 1 0.5炆远志2 1远志皂苷B 0.5 0.161 0.083 0.044 GSH/（μmol·g-1）96.346±9.531 36.121±0.20**46.527±0.528**56.399±0.347**46.321±0.293**▲▲56.572±0.43**▲▲66.504±0.492**▲▲60.255±0.243**▲▲■■72.173±0.63**▲▲■■84.273±0.382**▲▲■■10.209±0.603**▲▲■■14.294±0.45**▲▲■■16.371±0.523▲▲■■SOD/（μmol·g-1）831.071±12.434 380.486±5.025**442.168±8.513**500.310±7.941**400.341±10.530**▲▲460.636±11.904**▲520.165±12.070**▲560.378±10.460**▲▲■■634.384±8.364**▲▲■■696.834±9.240**▲▲■■105.400±9.342**▲▲■■122.592±1.412**▲▲■■157.291±2.457**▲▲■■MDA/（μmol·g-1）10.334±0.870 70.783±9.202**60.354±8.289**50.275±0.350**60.167±5.135**50.257±1.752**40.376±1.457**▲▲44.791±5.685**▲■34.474±1.142**▲▲■■24.426±1.787**▲▲■■34.417 ±6.134**▲▲■■30.271±1.127**▲▲■■25.435±1.346**▲▲■■

4 小结

远志中原型皂苷类成分（如远志皂苷B）既是远志祛痰镇咳、抗痴呆和脑保护的活性成分，也是对胃肠道刺激的毒性成分[1-4，17-19]。此类成分因炮制受热，糖苷键断裂，水解为毒性较低的细叶远志皂苷等成分，导致含量降低，从而降低胃肠道毒性。本文通过比较原型皂苷类中含量较高远志皂苷B的含量大小，结果显示生远志＞制远志饮片＞炆远志饮片。推测原因是由于炆法炮制需加热炮制16 h，时间长，而制远志炮制时间是几小时，时间较短，导致炆远志中远志皂苷B含量更低。另外，从IEC-6细胞胃肠道毒性试验结果可见，IC50和MDA、GSH、SOD的含量变化，均表明毒性大小为生远志＞制远志＞炆远志。推测远志皂苷B含量的降低为远志胃肠毒性减小的原因之一，该结果可为炆远志的炮制提供参考，为炆远志的“减毒”效应提供一定的科学依据。