一测多评法同时测定开喉剑喷雾剂（儿童型）中4 种成分

2022-07-22张金鹤石慧周英张丽艳张海董秀刘雄伟俸婷婷

中成药 2022年6期

张金鹤石慧周英张丽艳张海董秀刘雄伟俸婷婷*

（1.贵州中医药大学药学院，贵阳贵州550025； 2.贵州中医药大学药食两用资源应用与开发研究中心，贵阳贵州550025； 3.贵州三力制药股份有限公司，安顺贵州561100）

开喉剑喷雾剂（儿童型）是贵州三力制药股份有限公司生产的独家苗药大品种，由八爪金龙、山豆根、蝉蜕、薄荷脑组成，具有清热解毒、消肿止痛之功效［1］，临床上用于治疗儿童急性咽炎、扁桃体炎［2-3］、疱疹性口腔炎［4］、疱疹性咽峡炎［5］、手足口病［6］、鹅口疮［7］等疾病，疗效显著，而且安全性高，无不良反应。其中，收载至《贵州省中药材民族药材质量标准》的八爪金龙包含朱砂根、百两金、红凉伞三个基原，开喉剑喷雾剂组方所用药材为朱砂根。目前，关于开喉剑喷雾剂（儿童型）质量控制的研究较少，主要指标成分仅为岩白菜素和苦参碱［8-9］，专属性较差。前期报道，岩白菜素为朱砂根主要化学成分，具有良好的止咳、抗炎作用［10-11］；山豆根含有生物碱、黄酮、三萜等多种成分［12］，其中苦参碱具有抗炎、抑菌、保肝等作用［13］，三叶豆紫檀苷、马卡因在诱导白血病HL-60 细胞凋亡方面疗效显著［14］。因此，本实验采用一测多评法同时测定开喉剑喷雾剂（儿童型）中苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷、马卡因的含量，以期为该制剂质量控制奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；XS-205 型电子天平（十万分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 试剂与药物苦参碱（批号PS011495，纯度≥98.5%）、岩白菜素（批号PS010520，纯度≥98.0%）、三叶豆紫檀苷（批号PS012410，纯度≥98.0%）、马卡因（批号PS210802-06，纯度≥98.0%）对照品均购自成都普思生物科技有限公司。开喉剑喷雾剂（儿童型）（贵州三力制药股份有限公司，批号 20200706、20200720、20200730、20200733、20200736、20200748、20200804、20200805、20200812、20200814）。甲醇、磷酸、三乙胺均为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Platisil-ODS 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.1% 磷酸（三乙胺调节pH 至5.0）（B），梯度洗脱（0～8 min，10% A；8～19 min，10%～30% A；19～28 min，30%A；28～32 min，30%～40% A；32～40 min，40%～60% A；40～70 min，60%～100%A）；体积流量0.8 mL／min；柱温35 ℃；检测波长220 nm（苦参碱）、275 nm（岩白菜素）、300 nm（三叶豆紫檀苷、马卡因）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷对照品适量，置于10 mL 量瓶中；精密称取马卡因对照品适量，置于25 mL 量瓶中，甲醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，作为贮备液，分别精密量取3.5、4.0、1.0、0.6 mL，置于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，即得（各成分质量浓度分别为0.709 1、0.802 4、0.103 6、0.024 56 mg／mL）。

2.2.2 供试品溶液精密吸取本品2.5 mL，置于5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按本品处方工艺，分别制备缺朱砂根、缺山豆根的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性考察吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰均具有良好的分离度，与对照品色谱峰保留时间一致，并且未在相应阴性样品中检测出，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液0.4、1.2、2.0、2.5、3.5 mL，置于5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，制成系列质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷、马卡因峰面积RSD 分别为1.09%、1.68%、1.24%、1.16%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一批本品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷、马卡因峰面积RSD 分别为2.00%、0.81%、1.81%、0.88%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验取同一批本品6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得苦参碱、岩白菜素、三叶豆紫檀苷、马卡因含量RSD 分别为1.38%、1.18%、1.50%、1.55%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验精密吸取各成分含量已知的同一批本品1.25 mL，共6份，置于5 mL 量瓶中，加入对照品溶液（含苦参碱0.352 6 mg／mL、岩白菜素0.645 2 mg／mL、三叶豆紫檀苷0.056 45 mg／mL、马卡因0.013 50 mg／mL）1.25 mL，按“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 相对校正因子计算精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，以岩白菜素为内标，计算其他3 种成分相对校正因子fk／s，公式为fk／s＝fk／fs＝（WkAs）／（WsAk）（Wk为其他成分质量浓度，Ak为其他成分峰面积，Ws为内标质量浓度，As为内标峰面积），结果见表3。

表3 各成分相对校正因子Tab.3 Relative correlation factors of various constituents

2.10 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响考察Agilent 1260、Waters e2695 色谱仪及Platisil-ODS、Diamonsil-C18、Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）对相对校正因子的影响，结果见表4，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表4 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.11 不同柱温对相对校正因子的影响采用Agilent 1260 色谱仪、Platisil-ODS 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察柱温30、35、40 ℃对相对校正因子的影响，结果见表5，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.5 Effects of different column temperatures on relative correction factors

2.12 不同体积流量对相对校正因子的影响采用Agilent 1260 色谱仪、Platisil-ODS 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），考察体积流量 0.7、0.8、0.9 mL／min对相对校正因子的影响，结果见表6，可知均无明显影响（RSD＜5%）。

表6 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different volumetric flow rates on relative correction factors

2.13 色谱峰定位对各成分色谱峰进行定位时，主要采用相对保留时间定位法或保留时间差值定位法［15-17］。以岩白菜素为内标，计算其他3 种成分相对保留时间（ti／s）、保留时间差（Δti／s），结果见表7～8。由此可知，三叶豆紫檀苷、马卡因ti／s、Δti／s的RSD 均小于5%，但苦参碱两者RSD 均大于5%，故采用对照品定位。2.14 样品含量测定取10 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，分别采用外标法、一测多评法计算含量，结果见表9。由此可知，2 种方法所得结果相近（相对误差＜3%），表明一测多评法可用于含量测定。