超滤离心法对CVB-D 脂质体分离及包封率测定的效果分析

陈俊杰

（广州中医药大学第二附属医院药学部制剂科 广东 广州 510000）

CVB-D 是从黄杨科植物小叶黄杨及同属植物经酸性醇提、碱化、萃取、重结晶所得的甾体生物碱，也称环维黄杨星D 环常绿黄杨碱D、黄杨宁、黄杨碱等，有抗心律失常、抗心肌缺血、舒张血管、降血压等生理活性，临床用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常、心肌缺血等疾病。其分子式为CHN，是一种白色针状结晶，结构式见图1。中国药典（2000 版）采用非水滴定法测定CVB-D 含量，但此方法测定样品中总生物碱含量，缺乏专属性。

图1 CVB-D 结构式

脂质体是一种人工合成膜。磷脂分子亲水头端插入水中，亲水尾端伸向空气，混合搅拌后形成类脂质双分子层结构的球状脂质体。脂质体具有类似细胞膜的特点，可使药物递送到细胞内部。脂质体具有可包封难溶性药物、毒性小、生物相容性高等特点发展迅速。脂质体的质量评价包括形态、粒径、包封率、载药量和稳定性等，而包封率是筛选脂质体制备工艺和评价其质量的重要指标，对提高药物治疗作用、减轻药物不良反应以及降低药物剂量作用极大。在《中国药典（2010 版）》中，脂质体制剂指导原则中规定脂质体包封率不得小于80%。包封率的检测需分别测定脂质体药物总含量和脂质体外的游离药物含量，然后再通过公式得出包封率，而分离脂质体与游离药物的方法通常有采用柱层析法、超滤离心法、透析法、鱼精蛋白沉淀法、荧光法等。

本研究旨在采用超滤离心法从脂质体中分离出游离CVB-D 后，利用UPLC-MS/MS 测定CVB-D 含量，从而计算脂质体包封率。由于超滤离心法的离心速度和时间对超滤离心管洗脱能力影响较大，所以本实验先建立UPLCMS/MS 测定CVB-D 方法，再对离心速度和时间进行考察以确定超滤离心法的离心条件。

1.仪器与材料

1260-6460 三重四极杆液质联用仪（美国安捷伦公司），TLE204/02 万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器〈上海〉有限公司），超滤离心管（0.5 mL 10 KD，美国密理博公司），5 427 R 台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf 股份公司），微孔滤膜（天津津腾实验设备有限公司），CVB-D 对照品（批号161217，成都瑞芬思生物科技有限公司），甲醇（色谱纯，德国Merk 公司），乙腈（色谱纯，德国Merk 公司）甲酸铵（质谱纯，德国CNW 科技公司），其他试剂（分析纯，市售），水为自制超纯水。

2.方法与结果

2.1 UPLC-MS/MS 测定CVB-D 方法的建立

2.1.1 对照品制备 CVB-D 对照品溶液：精密称取CVB-D 对照品10.0 mg 置于100 mL 量瓶甲醇定容，即得到0.100 mg/mL 的CVB-D 对照品溶液。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Waters Xterra MS C18（2.1×50 mm 3.5 μm）；流动相：乙腈（A）- 含0.01 mol/L 甲酸铵的0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱程序（见表1）；流速：0.35 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL，检测离子对为m/z403.4 →372.1。

表1 梯度洗脱程序

2.1.3 线性关系考察 精密量取CVB-D 对照品溶液以甲醇定容配制成1 μL/mL、2 μL/mL、8 μL/mL、10 μL/mL、20 μL/mL、50 μL/mL，在上述建立的色谱质谱条件下进行检测。以色谱峰面积为纵坐标与样品浓度为横坐标进行线性回归（= 6），说明样品浓度在100 ～5 000 ng/mL 之间呈良好线性关系。结果见图2。

图2 UPLC-MS 测定CVB-D 标准曲线

2.1.4 专属性检验 分别取CVB-D 对照品溶液、空白脂质体各100 μL 混匀后以甲醇稀释至10 mL，再取CVB-D 对照品溶液100 μL 稀释至10 mL，分别在上述建立的色谱质谱条件下进行检测。CVB-D 特征峰的保留时间约3.8 min，无干扰且峰形良好，说明本方法具有较好的专属性，见图3。

图3 CVB-D 专属性试验

2.1.5 精密度考察 精密吸取对照品溶液1 000 μL置于10 mL 量瓶，甲醇定容，在2.1.2 下色谱质谱条件下连续进行5 次检测，记录CVB-D 的峰面积。结果见表2。说明仪器精密度符合要求。

表2 UPLC-MS 测定CVB-D 精密度考察

2.1.6 稳定性考察 使用移液枪吸取对照品溶液100 μL 置于10 mL 量瓶，甲醇定容，在10 mL 色谱质谱条件下，以首次测定时间点为0 h，在首次测定后的3 h，6 h，12 h，24 h 后进行质谱检测，记录CVB-D 的峰面积。结果表明，CVB-D 在此方法下24 h 内含量基本不变。

2.1.7 加样回收试验 精密吸取20 μL，100 μL，200 μL 对照品溶液置于10 mL 量瓶，甲醇定容，每个样品平行操作3 份。按照上述建立的色谱质谱条件，测定CVB-D 的峰面积，结果见表3，发现UPLC-MS 测定CVB-D的加样回收率符合样品的分析要求。

表3 UPLC-MS 测定CVB-D 加样回收试验

2.2 超滤离心法测定脂质体包封率方法的建立

2.2.1 CVB-D 脂质体的制备

精密称量CVB-D 10 mg，大豆卵磷脂100 mg，胆固醇20 mg，维生素E 10 mg，十八胺10 mg，以5 mL 无水乙醇超声溶解，减压旋蒸30 min，加入纯化水继续旋蒸水化1 h，探头超声3 s 停3 s 3 min 后，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.2破乳剂的选择 分别取0.1 mL CVB-D脂质体，分别加入1 mL 甲醇，无水乙醇，乙腈，10%曲拉通，5%SDS，再超声5 min，观察后，加入无水乙醇，10%曲拉通，5%SDS 的样品出现浑浊，表明破乳不完全，并将澄清的甲醇、乙腈破乳脂质体样品过0.22 μm 微孔滤膜，按2.1.2 项下质谱条件测定峰面积。结果发现，被甲醇破乳后的样品质谱峰面积最高。故本实验选取甲醇作为破乳剂。

2.2.3 超滤离心转速的考察 取0.5 mL CVB-D脂质体加入超滤离心管中，分别以2 500 r/min、3 000 r/min、3 500 r/min、4 000 r/min 的转速离心30 min。滤液过0.22 μm 微孔滤膜，按2.1.2 项下质谱条件进行测定，结果见表4，发现离心转速为4 000 r/min 时，峰面积最大，因此选择4 000 r/min 进行下面的实验。

表4 超滤离心转速的考察

2.2.4 超滤离心时间的考察 取0.5 mL CVB-D 脂质体置于超滤离心管中，在转速为4 000 r/min 分别离心20、30、40 min。滤液过0.22 μm 微孔滤膜，按2.1.2 项下质谱条件测定峰面积。

结果发现离心时间为40 min 时，峰面积最大，但滤液出现浑浊，表明因离心时间过长而使脂质体破裂。故后续实验选取30 min 作为离心时间。

2.2.5 超滤加样回收率 取1 mL 1 mg/mL CVB-D 溶液置于10 mL 量瓶以甲醇定容，取溶液0.5 mL、2 mL、4 mL以空白脂质体溶液定容至10 mL，取0.5 mL 于超滤管中以4 000 r/min 离心30 min。取1 mL 滤液在2.1.2 项下质谱条件测定CVB-D 含量，计算包封率，结果见表5，结果显示，此方法测定CVB-D 脂质体符合定量分析要求。

表5 CVB-D 加样回收率

2.3 结果

从上述实验结果可知采用流动相为乙腈-含0.1%甲酸的0.01 mol/L 甲酸铵溶液进行梯度洗脱程序测定CVB-D 的含量，在样品浓度为100 ～5 000 ng/mL 呈良好线性关系，符合其他方法选考察指标。超滤离心法条件为转速4 000 r/min 离心时间30 min。包封率的测定方法为：取0.5 mL 样品脂质体加入超滤离心管，以4 000 r/min 离心30 min，取滤液以甲醇稀释10 倍，以UPLC-MS 测定游离药物浓度C 游。另取0.1 mL 样品加甲醇定容至10 mL超声5 min破乳，以UPLC-MS测定浓度C总，以下列公式计算包封率：

3.讨论

由于CVB-D结构中不含可被紫外检测器检测的双键，《中国药典（2015 版）》中采用的酸性染料比色法通过紫外-可见分光光度法进行含量测定，也有文献报道采用蒸发光散射检测器（ELSD）检测CVB-D 的含量。其中，酸性染料比色法的专属性较低，而蒸发光散射检测器对仪器要求特殊。若使用HPLC-UV 法测定含量，通常使用柱前衍生化法使CVB-D 发生反应，从而衍生出双键可被紫外检测器检测，但衍生化试剂毒性大，衍生化容易使样品中其他成分反应影响CVB-D 检测结果。超滤离心法操作简单，用时短，但是耗材成本高，使用中也要注意大分子物质在离心力的作用下在滤膜表面聚集，形成浓差极化层，小分子物质难以透过，使滤膜的渗流量下降，分离效率降低。故需在测定前确定离心转速与时间。

综上所述，超滤离心法操作简便、重复性好，可以达到将脂质体与游离药物很好的分离的目的，用作CVB-D脂质体的分离并测定包封率。