出血性中风1 号方对脑出血大鼠脑组织的影响

张洁 吴 倩 王晓玲 唐 勇 吴宗涛

1.陕西中医药大学，陕西咸阳 712046；2.陕西省安康市中医医院，陕西安康 725000

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）占卒中24%[1]，属中医“中风”范畴，急性期治法以熄风、化痰、活血为主，目前临床中尚无证据表明活血化瘀药会其增加出血风险[2]。出血性中风1 号方有平肝熄风、凉血化瘀功效，有研究表明，该方对ICH 患者有脑保护作用，但机制尚不明确[3-5]。本研究探讨该方对ICH 模型大鼠脑组织的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 84 只雄性SD 大鼠，体重（220±20）g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2020-030，合格证号：0043162。本研究经过陕西中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 药物 出血性中风1 号方配方颗粒（水牛角15 g、钩藤10 g、牛膝10 g、生大黄6 g、栀子10 g，广东一方制药有限公司，批号：9116533、9120933、9100363、90713 91、9110873）。脑血疏口服液（山东沃华医药科技股份有限公司，批号：20070059）。

1.1.3 主要试剂与仪器 胶原酶Ⅶ（sigma，批号：C824248）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6 试剂盒，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65 抗体（武汉博士德，批号：EK0526、EK0412、A00284-1）；磷酸化NF-κB（phos phorylated NF-κB，p-NF-κB）p65 抗体（Affinity，批号：AF2006）。脑立体定位仪（成都泰盟科技有限公司，DW-2000），微量进样器（上海高鸽工贸有限公司，批号：HY20082702）。

1.2 研究方法

1.2.1 分组及给药 84 只大鼠中随机选取24 只，采用随机数字表法将其分为空白组和假手术组，每组12 只。剩余60 只采用胶原酶Ⅶ注射诱导ICH 模型，造模成功后采用随机数字表法将其分为模型组、脑血疏组（2.08 ml/kg）及出血性中风1 号方低、中、高剂量组（3.2、6.4、12.8 g/kg）。空白组、假手术组、模型组灌胃等量生理盐水，其余组灌胃对应剂量药物，1 次/d，连续7 d。

1.2.2 模型制备 参照文献[6-7]复制ICH 模型：5%水合氯醛（6 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，以前囟向后0.2 mm，向右3.0 mm，垂直下移5.5 mm 为注射点，微量进样器取1.5 μl 胶原酶Ⅶ注入右尾状核区。以Longa 评分1～3 分且取材观察到脑血肿为造模成功标准[8]。Longa评分标准[8]：无肢体活动不利记为0 分，左侧肢体不能完全伸展记为1 分，向左侧转圈记为2 分，向左侧倾倒记为3 分，不能自发行走记为4 分。空白组不处理，假手术组注射等量生理盐水。

1.2.3 标本采集 末次给药后麻醉，每组取3 只心脏灌注后取脑用于苏木精-伊红染色；3 只取右脑检测脑含水量；6 只取脑血肿周围组织，-80℃冰箱保存。

1.2.4 苏木精-伊红染色观察病理学变化 依次脱水、包埋、切片，苏木精-伊红染色，中性树脂封片，镜下观察，采集图像。

1.2.5 干湿重法测定脑含水量变化 取右脑，滤纸吸干水分后称重记为湿重，然后置于80℃烤箱中干燥24 h称重记为干重，脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%[9]。

1.2.6 酶联免疫吸附试验检测TNF-α、IL-6 取脑组织，按酶联免疫吸附试验试剂盒说明操作，检测光密度（optical density，OD）值（450 nm 处），计算TNF-α、IL-6 浓度。

1.2.7 Western blot 检测NF-κB 蛋白表达 每组取4 只的脑组织提取蛋白，SDS-PAGE 电泳，转PVDF膜，封闭，加入一抗p-NF-κB p65（1∶800）、NF-κB p65（1∶1500）、β-actin（1∶10 000，内参），4℃孵育过夜，加入二抗（1∶10 000）室温孵育，显色，Image J 处理图像，检测灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 对所得数据进行统计学分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 七组脑组织病理学结果

空白组、假手术组脑组织结构完整，模型组有大量红细胞及炎症细胞浸润，排列紊乱，水肿严重，出血性中风1 号方低、中、高剂量组均有少量红细胞。见图1。

图1 七组脑组织病理学结果（苏木精-伊红染色，400×）

2.2 七组脑含水量比较

空白组、假手术组脑含水量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。模型组脑含水量高于空白组，出血性中风1 号方中、高剂量组脑含水量低于模型组和出血性中风1 号方低剂量组（P ＜0.05）。出血性中风1 号方低剂量组、模型组脑含水量比较，出血性中风1 号方中、高剂量组脑含水量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1。

表1 七组脑含水量比较（%，）

表1 七组脑含水量比较（%，）

注 与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与出血性中风1 号方低剂量组比较，cP ＜0.05

2.3 七组脑组织TNF-α、IL-6 水平比较

空白组、假手术组TNF-α、IL-6 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。模型组TNF-α、IL-6 高于空白组，出血性中风1 号方中、高剂量组TNF-α、IL-6 低于模型组和出血性中风1 号方低剂量组（P ＜0.05）。出血性中风1 号方低剂量组、模型组TNF-α、IL-6 比较，出血性中风1 号方中、高剂量组TNF-α、IL-6 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 七组脑组织TNF-α、IL-6 水平比较（pg/ml，）

表2 七组脑组织TNF-α、IL-6 水平比较（pg/ml，）

注 与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与出血性中风1 号方低剂量组比较，cP ＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素-6

2.4 七组脑组织NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平比较

各组NF-κB p65 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。空白组、假手术组p-NF-κB p65 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。模型组p-NF-κB p65 高于空白组，出血性中风1 号方中、高剂量组p-NF-κB p65 低于模型组和出血性中风1 号方低剂量组（P ＜0.05）。出血性中风1 号方低剂量组、模型组p-NF-κB p65 比较，出血性中风1 号方中、高剂量组p-NF-κB p65 比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2、表3。

图2 七组脑组织NF-κB p65 及p-NF-κB p65 蛋白条带图

表3 七组脑组织NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平比较（）

表3 七组脑组织NF-κB p65 及p-NF-κB p65 水平比较（）

注 与空白组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；与出血性中风1 号方低剂量组比较，cP ＜0.05。NF-κB：核因子-κB；p-NF-κB：磷酸化核因子-κB

3 讨论

ICH 是神经科急危重症，治疗以清除血肿，脱水降颅压及处理并发症为主[10]。ICH 急性期以瘀血阻窍、风痰火炽证最常见，约占12.45%[11]。对ICH 患者予以活血化瘀治疗能促进血肿吸收，改善神经功能缺损，降低致残率[12-13]。研究表明，瘀热病机主要由炎症引发[14]。出血性中风1 号方中水牛角凉血止血为君药；钩藤熄风，大黄凉血逐瘀，合为臣药；佐以牛膝引火下行，栀子清热，共奏熄风清热化瘀功效。有研究表明，该方治疗ICH 的靶点集中在抑制炎症和细胞凋亡[15]。

脑水肿是ICH 常见继发病理改变，严重影响ICH进展及预后[16-17]。本研究显示，出血性中风1 号方中、高剂量组脑含水量低于模型组，提示该方能减轻脑水肿，与既往研究一致[18-19]。研究表明，NF-κB p65 表达及TNF-α、IL-6 水平与ICH 病情及预后呈正相关[20-23]。NF-κB 是由p65、p52、p50、RelB、c-Rel 组成的转录调节因子家族，以同源或异源二聚体形式存在，参与调控炎症、凋亡等过程[24-25]。正常情况下，NF-κB 与其抑制蛋白结合在细胞质中，处于非活化状态。ICH 血肿作为致炎物质激活小胶质细胞，引发NF-κB 抑制蛋白激酶被激活导致NF-κB 被释放，后者与DNA 上的κB 位点结合，促进TNF-α、IL-6 等炎症因子表达，加重继发性脑损伤[24,26-27]。本研究结果显示，出血性中风1 号方中、高剂量组抑制p-NF-κB p65 表达，降低TNF-α、IL-6 水平，提示该方可下调TNF-α、IL-6 等炎症因子的释放，进而抑制ICH 的炎症损伤。

综上所述，中、高剂量的出血性中风1 号方对ICH 大鼠有脑保护作用，可能与抑制p-NF-κB p65、TNF-α、IL-6 表达相关。