VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 在乳腺癌中的表达及与预后的关系分析

徐亮 王杜娟 黄述斌 谢 倩 李松梅

1.安徽省池州市人民医院病理科，安徽池州 247000；2.广东省东莞市厚街医院病理科，广东东莞 523900

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率持续升高，全球范围内，每年新诊断病例达168 万例[1]。乳腺癌早期及时进行手术治疗，可有效降低患者的病死率[2]，但术后仍存在病死风险。近年来，随着医学科技的发展，分子靶向治疗逐渐被应用于肿瘤治疗，因此，寻找合适的分子靶向治疗技术，对提高患者术后生存率具有十分重要的意义。S100 钙结合蛋白A8（S100 calcium binding protein A8，S100A8）是低分子量钙结合蛋白S100 的家族成员之一，具有免疫抑制及促进炎症因子分泌的作用[3]，S100A8 的差异表达与乳腺癌患者的远期生存率密切相关[4]。相关研究报道，miR-93参与结肠癌的发生、发展，其表达水平可能与癌症患者预后有所关联[5]。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进肿瘤微血管生成的重要因子，参与多种恶性肿瘤的发生、发展及转移、复发过程[6]，在早期乳腺癌患者癌组织中即可检出VEGF 高表达[7]。因此，本研究旨在探讨VEGF、HsamiR-93、S100A8 在乳腺癌中的表达及与预后的关系，以期为提高乳腺癌患者术后生存率提供新的分子靶向治疗思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年1 月至2018 年6 月安徽省池州市人民医院治疗并经病理确诊的77 例初发乳腺癌患者为研究对象，均为女性，发病年龄31～79 岁，平均（55.06±12.03）岁；肿瘤直径1.2～3.3 cm，平均（2.24±0.48）cm；组织学分级：Ⅰ级15 例，Ⅱ级42 例，Ⅲ级20 例；TNM 分期：Ⅰ期19 例，Ⅱ期29 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期10 例；有淋巴结转移41 例，无淋巴结转移36 例。纳入标准：①符合乳腺癌相关诊断标准[8]，经病理学检查确诊；②患者家属愿意配合电话随访研究，且能提供患者具体死亡时间。排除标准：入组前已接受过放化疗或靶向治疗。本研究经医院伦理委员会批准同意，伦理审批号为：CZ20190032。

1.2 观察指标

1.2.1 VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 蛋白检测 主要实验试剂：VEGF、S100A8 免疫组织化学法检测试剂盒（货号：MAB-0243、MAB-0845）由迈新公司提供；MK1030 原位杂交检测试剂盒（货号：MK1030）和寡核苷酸探针稀释液（货号：AR0062）由武汉博士德公司提供；地高辛标记的Hsa-miR-93 探针（货号：ORB220703）由Biorbyt 公司提供；DAB 显色试剂盒（货号：GK348010）由基因科技（上海）股份有限公司提供。

所有患者手术治疗后获得病理标本（癌组织以及距离癌组织3～5 cm 的癌旁正常组织）经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4 μm。免疫组织化学法检测癌组织和癌旁正常组织中VEGF、S100A8 的表达：常规脱蜡、水化，所有操作严格按照说明书执行，采用PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照，已知抗体阳性标本作为阳性对照。原位杂交方法检测HsamiR-93 的表达：常规脱蜡，每个切片上加适量混匀的地高辛标记的探针溶液，加盖玻片，湿盒中42℃杂交16 h，放入适量HRP 标记的抗地高辛抗体，37℃孵育30 min 后，加入适量DAB 显色液进行显色，采用探针稀释液替代探针作阴性对照，已知抗体阳性标本作为阳性对照。切片均置于苏木精中染色2 min，显微镜下放大200 倍进行观察。结果判定：均由病理科医师参照Axiotis 病理评分标准[9]根据染色强度和阳性细胞比例进行判定：无染色或染色不明显，阳性细胞比例＜10%，记1 分；中等强度染色，阳性细胞比例在10%～50%，记2 分；强染色，阳性细胞比例＞50%，记3 分；总分=染色强度分数×阳性细胞比例分数，≥3 分为阳性表达。

1.2.2 生存资料 自患者出院之日起，每1～3 个月通过电话或门诊相结合的方式随访1 次，随访时间截至2021 年6 月，随访时间为6～36 个月，随访至终止时间或患者死亡，记录患者生存情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，两组间差异比较采用log-rank 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及癌旁正常组织中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 阳性表达率比较

乳腺癌组织中的VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 阳性表达率分别为68.83%（53/77）、74.03%（57/77）、61.04%（47/77），高于癌旁正常组织中的15.58%（12/77）、14.29（11/77）、12.99（10/77）（χ2=44.749、55.722、38.131，P ＜0.05）。见图1～3。

图1 VEGF 在乳腺癌组织中的表达

2.2 临床病理特征与癌组织中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 阳性表达的关系

图2 Hsa-miR-93 在乳腺癌组织中的表达

图3 S100A8 在乳腺癌组织中的表达

癌组织中VEGF 阳性表达与淋巴结转移有关（P ＜0.05），与年龄、组织学分级、TNM 分期、肿瘤直径无关（P ＞0.05）；癌组织中Hsa-miR-93 阳性表达与TNM分期、淋巴结转移有关（P ＜0.05），与年龄、组织学分级、肿瘤直径无关（P ＞0.05）；癌组织中S100A8 阳性表达与组织学分级、TNM 分期、淋巴结转移有关（P ＜0.05），与年龄、肿瘤直径无关（P ＞0.05）。见表1。

表1 临床病理特征与癌组织中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 阳性表达的关系

2.3 VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 不同表达与患者生存率的关系

截至随防时间，77 例乳腺癌患者存活37 例，死亡40 例。癌组织中VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 阳性表达患者的3 年总生存率为45.28%（24/53）、45.61%（26/57）、42.55%（20/47）；阴性表达患者的3 年总生存率为54.17%（13/24）、55.00%（11/20）、56.67%（17/30）。两组VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 生存曲线比较，差异无统计学意义（χ2=1.150、1.197、2.819，P=0.283、0.274、0.093）。VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 阳性表达患者中位生存期分别为22.00、20.00、17.00 个月；阴性表达患者中位生存期分别为27.25、28.60、28.53 个月。见图4。

图4 VEGF、Hsa-miR-93、S100A8 不同表达患者的生存曲线

3 讨论

乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控的现象。乳腺癌常表现为乳房肿块、乳头溢液、腋窝淋巴结肿大等症状，其发病原因尚不清楚，但多数研究报道可能与遗传因素、生育状况、月经初潮及绝经年龄等多种因素有关[2,10-11]。随着分子生物学的迅猛发展，催生了许多新技术，应用靶向技术向肿瘤区域精确递送药物的“靶向治疗”和利用肿瘤特异的信号传导或特异代谢途径控制的“靶点治疗”是肿瘤研究的热点。

本研究结果显示，VEGF 在乳腺癌组织的阳性表达率为68.83%，高于癌旁正常组织，其中VEGF 的表达与淋巴结转移有关。VEGF 是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有调控血管内皮细胞的增殖、迁移、存活，引起血管通透性改变，控制血管新生的作用[12]；另有研究报道，VEGF 也是一种血管通透性诱导因子，可引起微血管渗透性增强，导致血管肿瘤，并加快肿瘤生长和转移[13]。刘岩岩等[14]的研究报道，VEGF 在乳腺癌组织中的表达显著上调，且与病理类型和淋巴结转移密切相关。本研究结果结合上述报道，进一步说明VEGF 高表达可能会促进乳腺癌的发生、发展，其可能通过增加肿瘤干细胞的自我更新，促进血管内皮细胞的增殖和血管密度的增加，进而促进肿瘤的生长。本研究结果显示，miR-93 在乳腺癌组织的阳性表达率为74.03%，高于癌旁正常组织，其中miR-93 的表达与病理类型和淋巴结转移有关。miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，在真核基因表达调控中有着广泛的作用，参与多种恶性肿瘤的发生发展[15]。相关研究报道[16]，miR-93 在肝癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中表达上调。杨正勤等[17]研究报道，miR-93 在子宫内膜癌中的表达显著上调，且与临床分期和淋巴结转移密切相关。本研究结果结合上述报道进一步说明，miR-93 可能是一种原癌基因，其可能通过调控靶基因影响细胞周期和细胞凋亡，促进乳腺癌的发生、发展。本研究结果显示，S100A8 在乳腺癌组织的阳性表达率为61.04%，高于癌旁正常组织，其中S100A8 的表达与组织学分级、TNM 分期、淋巴结转移有关。S100A8是嗜中性粒细胞和单核细胞表达的促炎蛋白，在细胞因子的刺激下发挥重要的促炎效应[18]；S100A8 不仅仅参与影响血液病的病情发生、发展，更是在多种实体性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，成为肿瘤预后相关研究的新热点分子[19-20]。相关研究表明，S100A8在膀胱癌组织中呈高表达，且与肿瘤的侵袭及转移的病理特征高度相关[21]；随病理分期增高及分化程度降低，肺癌组织中S100A8 表达阳性率增高[22]。本研究结果结合上述报道说明，S100A8 可能会促进乳腺癌的发生、发展，可能的机制为S100A8 与机体内酪蛋白激酶发生作用，活化细胞内酪氨酸激酶。相关研究报道，酪氨酸激酶具有促进细胞生长、增殖的作用[23]。

本研究结果显示，VEGF、Hsa-miR-93、S100A8阳性表达乳腺癌患者生存率与阴性表达比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。但既往有研究表明，VEGF 介导转化生长因子-β 由抑癌活性转为促癌活性，进而诱导miR-93 表达，刺激上皮细胞-间充质转化，进而促进癌症复发、转移，增加患者病死风险；S100A8 的分泌涉及多种细胞因子，包括多种白介素相关因子[24-25]。提示VEGF、miR-93、S100A8 高表达可能会影响患者预后，本研究与上述报道存在差异，可能是由于本研究病例数较少无法得出此结论，后期需进一步采用大样本临床试验针对VEGF、miR-93、S100A8 对乳腺癌患者预后影响进行深入研究。

综上所述，VEGF、miR-93、S100A8 在乳腺癌组织中呈高表达，且阳性表达率均与淋巴结转移相关。但VEGF、miR-93、S100A8 参与乳腺癌发生发展的具体机制尚不清楚，还需要进一步采用动物试验或体外细胞试验进行深入研究，探索VEGF、miR-93、S100A8 作为乳腺癌治疗靶点新方向的可能性。