一种鬼笔属真菌分离鉴定和挥发性成分分析

易雪倩 徐 宁 王小艳，3 黄晓辉 刘祝祥*

（1 吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000；2 湖南省食用菌研究所，湖南长沙 410000；3 陆良爨乡绿圆菇业有限公司，云南曲靖 655000）

冬荪（）隶属鬼笔科（Phallaceae）鬼笔属（），多生长在林下腐殖质层中，东南亚、欧美等地有广泛分布，在中国主要分布在贵州、四川、云南等地。Li 等（2020）通过形态学与分子系统发育分析结果证实冬荪为鬼笔属的一个新种，其孢子形态较其他鬼笔属真菌更小，也更接近椭圆形，菌盖不凹陷，在此之前冬荪一直被误认成白鬼笔（）。冬荪含有多种活性成分（Kikuchi et al.，1984），如二氢查耳酮、麦甾醇、乙酸、苯基巴豆油醛、甲醛、糖醛酸聚糖、苯乙酸和硫化氢等，具有调节免疫，促进伤口愈合的特性，对治疗癌症、风湿、活血祛痛有一定辅助功效（Kalač，2009；Vyacheslav et al.，2019），还可用作食品防腐剂。

挥发性成分是构成食用菌风味品质的重要组成之一（王凤丽 等，2018），通过分析食用菌挥发性成分的组成和含量，有助于深入了解食用菌的风味特征，对食用菌的品种改良、定向育种及加工应用都具有重大意义。食用菌的挥发性成分主要包括八碳化合物及其衍生物、萜烯类、含硫化合物以及醛类、酸类、酮类、酯类等。其中，以八碳化合物和含硫化合物为主，醛、酸、酮、酯类等与它们互补，各组分间相互协调、平衡，呈现香味（温泉和王锡昌，2006）。鬼笔属真菌子实体大都具有浓郁的气味（Pudil et al.，2014），含有多种挥发性成分。顶空固相微萃取是20 世纪90 年代发展起来的一种用于食品风味物质分析检测的技术，通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用（SPME-GC-MS）技术可以对挥发性成分进行测定和分析（李文 等，2012；殷朝敏 等，2019），具有更高的准确度和更好的重复性，在挥发性成分分析方面已得到广泛利用。李文等（2012）利用该方法综合测定了田头菇子实体的挥发性成分，李晔（2013）通过该方法分析了灰树花中的挥发性成分，殷朝敏等（2019）利用此方法测定出香菇、平菇、杏鲍菇和金针菇等蘑菇鲜品中关键挥发性风味成分。此外，该方法在美味牛肝菌、羊肚菌、糙皮侧耳、秀珍菇、红平菇、竹荪、草菇等食用菌挥发性成分研究方面也有应用（曹蓓等，2013；李翔 等，2018；殷朝敏 等，2018；孙燕 等，2019）。

采摘冬荪时，常将菌盖作为废物丢弃，产生了极大的浪费，冬荪的菌盖含有多种挥发性成分，若能够很好的开发利用，不仅能改善环境污染问题，还有利于发展地区经济。目前对冬荪的研究报道主要集中于生物学特性及化学成分方面（Largent et al.，1977；Largent，1986；卢东升 等，2010；李文力 等，2016；王玉珠 等，2020），还未有利用顶空固相微萃取法检测其挥发性成分的相关报道。为更好的了解冬荪挥发性成分组成及含量，本试验对采自湖南西部疑似冬荪的野生大型真菌进行鉴定，并采用顶空固相微萃取法提取其菌盖挥发性成分，使用气相色谱-质谱联用技术进行测定分析，以期为冬荪的风味评估和进一步研究及开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生大型真菌（成熟子实体）于2020 年6 月采摘于湖南省古丈县高望界国家级自然保护区，2020 年7—8 月在吉首大学实验室进行形态学观察和分子系统学鉴定；然后，采用SPME-GC-MS 技术测定其挥发性成分组成及含量。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学观察 子实体形态学观察参考前人真菌分类方法（Largent et al.，1977；Largent，1986），使用5%氢氧化钾溶液浸泡子实体，使子实体软化；利用1%刚果红试剂对子实体的菌盖、菌褶、菌肉、菌柄和菌环等部位进行染色观察，颜色名称对照Kornerup 和Wanscher（1963）的手册进行描述。利用光学显微镜Leica D600（徕卡显微系统有限公司）进行微观形态特征观察。

1.2.2 分子系统学鉴定 采用真菌DNA 提取试剂盒〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕提取待鉴定真菌DNA。利用通用ITS 引物ITS1（5 ′ -TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3 ′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕进行PCR 扩增。PCR 反应体系25 μL：1 μL DNA 模板、1 μL primer ITS1、1 μL primer ITS4、12 μL 2×PCR MasterMix〔生工生物工程（上海）股份有限公司〕、10 μL ddHO。PCR 扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35 个循环；72 ℃延伸8 min。PCR 扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，运用最大似然法（ML）构建系统进化树。

1.2.3 菌丝生长速率测定 在采摘的4 个不同子实体菌盖与菌柄连接处取直径为5 mm 的组织块于PDA 平板培养基中分离培养，标记为D-1、D-2、D-3、D-4。菌丝长满整个平板后，转接至18 cm ×15 mm 的装有15 mL PDA 培养基的试管中，重复3次，置于（25 ± 2）℃培养箱中黑暗培养。培养20 d 后，根据菌丝在试管上延伸程度测量菌落直径（对于形状不规则的菌落，测量菌落直径的最大处），计算菌丝生长速率。

菌丝生长速率=（第20 d 所测菌落直径-接种块直径）/20

1.2.4 挥发性成分提取及含量测定 采用顶空固相微萃取法萃取真菌挥发性成分，将真菌菌盖剪成碎块，称取2 g，放入15 mL 顶空瓶中，水浴锅50 ℃，平衡40 min，将PDMS/CAR/DVB 萃取纤维头在280 ℃条件下老化30 min 后，插入顶空瓶，吸附30 min，取出萃取纤维头插入GC-MS 仪（6890N-5975B，美国Agilent 公司）进样口，解析5 min 后，采集数据。

气相色谱条件：采用Agilent190191S-433 型石英毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯He（纯度大于99.99%），载气流量1 mL·min，进样量1.0 μL，进样口温度280 ℃，不分流进样。升温程序：初始温度35 ℃，保持5 min；以5 ℃·min的速率升温至110 ℃，保持2 min；以6 ℃·min的速率升温至150 ℃，保持2 min；以8 ℃·min的速率升温至220 ℃，保持10 min；溶剂延迟3 min。

质谱条件：EI 离子源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，质量扫描范围30～500 amu。

根据真菌挥发性成分GC-MS 总离子流色谱图解析各个峰所对应的质谱图，采用Xcalibur 1.2 软件与NIST98 所提供的标准物质谱图库及相关文献进行比对，根据离子流峰面积归一化法计算各组分在总挥发物中的相对含量。

2 结果与分析

2.1 形态特征

通过宏观形态特征和显微特征比较（图1），初步鉴定采集到的大型真菌为鬼笔属冬荪。子实体白色蕾球形，基部有菌托；菌托呈淡黄色苞状，厚且具有弹性；菌盖呈钟形，淡黄色，有深网格，成熟后顶平，带有穿孔，附有棕黑色的孢子液，带有黏性和特殊气味；菌柄白色，海绵状，内部中空，近圆筒形，由无色的泡状及柱状细胞组成；孢子大小为（1.80～2.31）μm ×（3.70～4.58）μm，无色，杆状，平滑。

图1 冬荪形态

2.2 分子系统学分析

将得到的鬼笔属真菌ITS 序列连同从GenBank下载的相关种及外类群的ITS 序列一起构建系统发育进化树，其中（任氏蛇头菌）为外类群。如图2 所示，采集到的大型真菌（图中为红色）聚在鬼笔属类群内，与GenBank登录号为MW785851 的以100 的Bootstrap 值处于同一分支，鉴定其为冬荪（），属于鬼笔科（Phallaceae）鬼笔属（），也是Li 等（2020）所描述的新种。

图2 鬼笔属真菌基于ITS 序列构建的系统进化树

2.3 菌丝生长速率

在PDA 培养基中，冬荪不同子实体分离的菌丝生长情况见表1。其中，D-2 的菌丝生长速度最快，适宜作为进一步驯化利用的菌种。

表1 冬荪不同子实体菌丝生长速率

2.4 挥发性成分分析

冬荪样品经GC-MS 联机分析后，相应的质谱总离子流图谱如图3 所示，共检出72 种挥发性成分，占总峰面积（相对含量）的94.925%，烃类18 种、酯类12 种、脂肪酸8 种、苯环类8 种、酮类6 种、醇类5 种、醛类5 种、醚类4 种、杂环类6 种，其中主要成分为苯甲醚、邻苯二甲醚、苯乙醇、对苯二甲醚，苯甲醚相对含量最高，为35.513%（表2）。香气成分有23 种，占总成分的72.805%，其中苯甲醚、苯乙醇、对苯二甲醚、苯乙醛和正戊醇含量较高，是冬荪香气的重要组成成分，其他的香气成分起协调互补作用。

图3 冬荪挥发性成分TIC 总离子流图谱

表2 冬荪挥发性成分

续表

3 结论与讨论

本试验采用形态学观察和分子系统发育分析相结合的方法，鉴定出采自湖南西部的野生大型真菌为冬荪（），属于鬼笔科（Phallaceae）鬼笔属（），并分离得到了菌丝，PDA 培养基中菌丝生长满管需要20 d；采用SPME-GC-MS技术检测冬荪的挥发性成分，共鉴定出72 种，相对含量为94.925%，其中香气成分23 种，相对含量为72.805%。

冬荪作为一种药食两用真菌，具有多种挥发性成分，目前还未得到很好的研究开发。本试验对冬荪子实体挥发性成分进行分析鉴定，得到72 种挥发性化合物，其中碳氢类化合物含量最多，明确了冬荪所含的特征性风味物质种类，起主要作用的香气挥发性物质为苯甲醚、苯乙醇、对苯二甲醚、苯乙醛和正戊醇。李文力等（2016）从黔产白鬼笔菌盖、菌柄、菌托3 个部位的提取物中共检出67 种化学成分。除苯乙醛外，其余66 种成分在有关白鬼笔的研究中未见报道。其中检测出的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、异山梨醇、顺，顺-9，12-十八碳二烯酸、α-吡咯烷酮、烟酰胺、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）及邻苯二甲酸二丁酯（DBP）等成分具有一定的抗氧化、增塑等功效；检测出的香气物质有5-甲基糠醛、2-呋喃甲醇、1-庚醇、1-己醇、1-壬醇、1-辛醇、十六酸乙酯、苯乙醛及己酸共9 种，这些成分可能构成了白鬼笔的白萝卜香味，与本试验检出的相同成分有苯乙醛。陈曦等（2012）利用DB-1701 中等极性柱对竹荪的二氯甲烷提取物进行分离，采用气相色谱-质谱联用仪进行检测，共鉴定出118 种挥发性成分，包括苯乙醛、苯乙醇、2-乙酰基吡咯、呋喃甲醛、β-绿叶烯、亚油酸、α-羟基-苯丙酸甲酯、异长叶烯酮、雪松烯等，检出率为相对峰面积总量的87.25%，与本试验检出的相同成分有苯乙醛、苯乙醇2 种。孙燕（2019）采用顶空固相微萃取GC-MS 联用技术检测了红托竹荪和棘托竹荪的挥发性成分组成及含量，结果分别为72 种、95.279%和55 种、94.392%，气味组成成分及含量分别为36 种、27.713%和29 种、16.862%，与本试验检出的相同成分有苯甲醛、苯乙醇、香叶基丙酮3 种。本试验检测到的冬荪挥发性成分中，苯甲醚、邻苯二甲醚、苯乙醇和对苯二甲醚均可用于有机合成，也常用作食品用香精，用途广泛；棕榈油酸也对一些慢性疾病如炎症、代谢综合症和糖尿病的治疗有一定作用（Wu et al.，2012）；愈创木酚广泛应用于香精香料、染料以及医药的合成。对于相对含量较高的化合物之间的比例、阈值等是否是形成冬荪香味和风味物质的关键，还需进一步深入研究。本试验的结果可用于建立和完善食用菌香气数据库，为冬荪的综合利用提供参考依据。