外施蔗糖促进黄瓜侧枝伸长

张泽钦 周朝阳张小兰

（农业生物技术国家重点实验室，设施蔬菜生长发育调控北京市重点实验室，教育部作物分子育种国际合作联合实验室，中国农业大学园艺学院，北京 100193）

侧枝是植物的重要性状之一，影响野生物种在自然环境中的适应性以及农业、园艺和林业作物的产量（Evers et al.，2011）。作物侧枝起源于腋生分生组织，其生长发育一般分为两个阶段：侧芽起始（initiation）和伸长（outgrowth）（McSteen &Leyser，2005）。

侧芽起始受到多个基因调控，其中最为重要的是拟南芥的（）及其在水稻中的同源基因（）和番茄中的同源基因（Schumacher et al.，1999；Grassini et al.，2013；Lu et al.，2015），编 码1 个GRAS 家族的核蛋白。该基因突变后拟南芥和番茄营养生长阶段不产生侧枝；在生殖生长阶段，侧生分生组织出现在叶腋，并诱导侧枝和花序的产生，但在水稻中不产生分蘖，花序、小穗明显减少。此外，水稻（）和及其在玉米中的同源基因（）、拟南芥中MYB 家族成员（）、、以 及CUC2/3-DA1-UBP15 调控模型等均被报道参与腋生分生组织的起始（Müller et al.，2006；Tabuchi et al.，2011；Yao et al.，2019；Li et al.，2020）。目前对于侧枝伸长的研究主要集中在TCP 基因家族转录因子。玉米和水稻中的同源基因（）、拟南芥和番茄中的同源基因（）均被报道参与侧枝伸长的负向调控（Aguilar-Martinez et al.，2007；Minakuchi et al.，2010；Martin-Trillo et al.，2011；Studer et al.，2011）。/作为植物侧枝伸长的中央调控因子，整合了（）、（）、（）、（-）等 基因，以及Auxin、CKs（cytokinins）、Gas（gibberellic acids）、SLs（strigolactones）、ABA（abscisic acid）、BRs（brassinosteroids）及光信号等多种调控途径共同调控侧枝伸长（Kotov et al.，2021）。除此之外，糖类物质也在侧枝发育调控网络中扮演着重要角色：豌豆去除顶端，糖类物质会先于生长素重新分配并在腋芽中积累，抑制的表达，触发腋芽释放与生长；在细胞中过表达果糖-1，6-二磷酸酶可提高拟南芥体内蔗糖水平，降低基因表达水平从而促进侧枝生长（Otori et al.，2017）。对番茄、高粱和小麦侧枝的研究也表明蔗糖供应与表达降低及腋芽生长密切相关（Kebrom et al.，2012；Kebrom &Mullet，2015；Xia et al.，2021）。

分枝是黄瓜主要的农艺性状之一，较少的侧枝已成为了驯化过程中选择的目标。目前，黄瓜的（）基因已经被克隆，在侧芽起始的部位高表达，异源表达可以恢复拟南芥突变体的腋芽形成缺陷表型（Yuan et al.，2010）。黄瓜基因同样可以抑制侧枝的伸长（Shen et al.，2019），然而，糖类物质是否能调控黄瓜侧枝的发育还鲜见报道。本试验中，笔者对华北密刺型黄瓜品系461 外源喷施蔗糖溶液，观察到黄瓜侧枝明显伸长，转录组和real-time PCR分析显示蔗糖可以调控侧枝伸长基因的表达。试验结果表明蔗糖调控黄瓜侧枝的伸长，进一步完善了黄瓜侧枝发育调控网络。

1 材料与方法

1.1 试验材料及生长条件

供试材料为保存于中国农业大学的华北密刺型黄瓜品系461（Shen et al.，2019），试验于2021 年9 月初开展。挑选饱满的种子，55～60 ℃水中浸种3～4 h，随后放在铺有滤纸的培养皿中，置于28℃培养箱黑暗条件下萌发24 h，选取发芽较为一致的种子播种到装有进口草炭与蛭石的穴盘中。待黄瓜幼苗生长到两叶一心时定植于中国农业大学西校区科学园塑料大棚中。

1.2 植株处理及侧枝测量方法

待黄瓜第5 片真叶展开后，用0、20、40、60 mmol·L蔗糖水溶液分别对黄瓜植株进行全株均匀喷施至喷湿不滴落，分别记为CK、E20、E40、E60，每日1 次，处理直至黄瓜15 节位结束。每个处理喷施10 株。试验结束后用刻度尺及游标卡尺测量植株各节位侧枝长度并进行统计，每个处理统计5 株作为5 个重复。

1.3 转录组测序及分析

待植株长到12 节位高度时，取40 mmol·L蔗糖处理组（E40）和对照组（CK）第11 节位2 mm 腋芽用于转录组测序分析，对照组和处理组各3 个生物学重复，测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。利用基因表达差异倍数大于1.5，P-value低于0.01 来确定蔗糖处理前后差异表达基因并在百迈客云平台（www.biocloud.net）进行数据分析。

1.4 实时荧光定量PCR 分析

取40 mmol·L蔗糖处理组及对照组植株相同节位腋芽用RNA 提取试剂盒（普洛麦格生物技术有限公司，LS1040）提取总RNA，用反转录试剂盒（天根生化科技有限公司，KR118-02）反转录为cDNA，用TB Green® Premix Ex TaqII（宝日医生物技术有限公司，RR820A）荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR 反应，以黄瓜基因（Csa000874）为内参基因，采用2计算方法对数据进行分析。试验进行3 个生物学重复。

2 结果与分析

2.1 蔗糖促进黄瓜侧枝伸长

用不同浓度的蔗糖溶液对黄瓜品系461 进行喷施处理，对各节位侧枝长度进行统计分析。与对照组相比，20 mmol·L蔗糖溶液处理组，第3、5节位的侧枝有显著伸长；40 mmol·L蔗糖溶液处理组，第2～6 节位的侧枝均有显著伸长；60 mmol·L蔗糖溶液处理组，第4～5 节位的侧枝有显著伸长（图1）。以上结果表明外源喷施蔗糖可以促进黄瓜侧枝生长，且40 mmol·L蔗糖溶液促进侧枝伸长的效果最为显著。

图1 不同浓度蔗糖溶液对黄瓜侧枝发育的影响

2.2 蔗糖处理后黄瓜腋芽转录组分析

为了进一步研究蔗糖促进黄瓜侧枝伸长的分子机制，选取40 mmol·L蔗糖溶液处理组（E40）及对照组（CK）第11 节位2 mm 腋芽进行转录组测序分析，共得到40.45 Gb Clean Data。各样品的Clean Data Q30 碱基百分比均不小于93.08%。分别将各样品Clean reads 与指定黄瓜参考基因组进行序列比对，各样品的reads 比对效率在95.96%～96.59%之间。主成分分析（principal component analysis，PCA）结果显示对照组和E40处理组的重复性较好（图2）。以上结果表明RNAseq 数据可用于下一步分析。以蔗糖溶液处理组与对照组相比基因表达差异倍数大于1.5，P-value 低于0.01 来筛选差异表达基因，共得到568 个差异表达基因，其中150 个基因表达上调，418 个基因表达下调（图3-A）。对差异表达基因进行GO（gene ontology）富集分析，差异表达基因主要富集在生物节律、信号转导以及转录因子活性、电子转运载体、催化活性等生物学过程（图3-B）。

图2 样本主成分分析

目前已报道的参与植物侧枝发育的基因大部分为转录因子，因此选取具有转录因子活性且与植物侧枝发育相关的部分基因绘制热图，差异表达基因主要集中在AP2/ERF、MYB、NAC、TCP 基因家族中。其中，相对于对照组，E40 处理组中与侧芽起始相关的基因CsaV3_3G003590（）上调表达1.62 倍；另外，响应糖信号的生物钟组分CsaV3_5G020710（）以及与远红光反应相关的基因CsaV3_6G009090（）表达均有差异（图3-C）。

图3 蔗糖处理后黄瓜腋芽转录组分析

进一步通过real-time PCR检测CsaV3_3G003590（）的表达，相对于对照组，E40 处理组中CsaV3_3G003590（）表达上调超过了20 倍（图4-A）。已有研究结果表明蔗糖可以抑制基因的表达促进侧枝的伸长（Shen et al.，2019），虽然在转录组中下调不明显，但real-time PCR 试验结果显示，蔗糖处理后基因下调表达0.6 倍（图4-E）。此外，荧光定量结果表明，分生组织维持相关基因、以及花器官发育相关基因均有不同程度表达量的变化（图4-B、4-C、4-D）。以上结果表明蔗糖通过调节相关基因的表达促进侧枝的伸长。

图4 侧枝发育相关基因相对表达量分析

3 讨论与结论

侧枝是黄瓜的主要农艺性状，已有研究表明生长素调控黄瓜侧枝伸长（Shen et al.，2019），而其他调控因子尚未见报道。本试验研究发现，蔗糖可通过调节相关基因的表达促进黄瓜侧枝的伸长。

糖类物质不仅可以作为营养物质也可以作为信号物质调控植物的生长发育（Rolland et al.，2006；Wind et al.，2010）。分枝已经逐渐成为了研究糖信号调控植物发育的模型（Yadav et al.，2014），外源施加蔗糖可以快速诱导侧枝的发育。之前的研究表明在豌豆侧芽中糖通量以及侧枝的伸长与的表达量降低在时间上相吻合（Mason et al.，2014）。本试验对黄瓜幼苗外施蔗糖显著地增加了侧枝的长度（图1），荧光定量PCR 结果显示蔗糖同样可以抑制黄瓜基因的表达（图4），表明在黄瓜中蔗糖通过抑制的表达促进侧枝的伸长。最近研究发现外源喷施细胞分裂素可以促进分枝的伸长，并且蔗糖通过细胞分裂素诱导芽的伸长（Salam et al.，2021），暗示蔗糖可能通过促进细胞的分裂调节侧枝的伸长。

非常有趣的是，转录组和荧光定量PCR 结果显示蔗糖促进了侧芽起始基因的表达。与对照组相比，很多参与分生组织维持的基因表达量也发生了改变。在蔗糖处理后的转录组数据中，CsaV3_1G001430（）表达明显上调（图3-C），突变后分生组织发育有缺陷（Belles-Boix et al.，2006）。蔗糖处理后，与CLAVATA3 信号传导及STM 维持相关的CsaV3_6G007770（）和CsaV3_5G027900（）基因分别上调和下调表达（图3、4）（Müller et al.，2008；Kinoshita et al.，2010；Durbak &Tax，2011），暗示着蔗糖也可能参与调控黄瓜侧枝的起始。

除此之外，光信号也会影响侧枝发育。光敏色素B（）突变会降低植物感知红光与远红光的比率（R/FR），促进的表达，从而抑制侧枝生长（Finlayson et al.，2010；González-Grandío et al.，2013）。本试验中蔗糖处理后CsaV3_6G009090（）基因表达明显下调（图3）。可以抑制phyA 介导的远红光反应（Oh et al.，2020），这暗示着糖信号可能与植物光信号通路互作调控植物侧枝的发育。

综上所述，蔗糖通过调控一些与侧枝发育相关基因的表达来调控黄瓜侧枝的长度。