新疆地区蓝舌病病毒的分离鉴定及编码VP5外壳蛋白的基因序列分析

马晓菁，薛晓波，叶 锋，刘丽娅，古丽扎提·塔力甫汗，谷文喜，易新萍*

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床研究中心，乌鲁木齐 830002；2.新疆畜牧科学院畜牧业经济与信息研究所，乌鲁木齐 830002）

蓝舌病（Bluetongue，BT）是由呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）的蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的经媒介昆虫如库蠓、伊蚊等传播的非接触性病毒性传染病[1]。绵羊对该病最为易感，病死率通常为2%~30%，有时高达70%~100%[1]。蓝舌病不仅对畜牧业生产造成直接经济损失，同时对国际贸易也造成较大影响。蓝舌病病毒血清型众多且变异快，目前全球有29个血清型的BTV，亚洲至少存在27个血清型的BTV[2,3]。新的血清型及强毒株的出现，应引起我国的高度重视。1979年，云南省的师宗县首次检测出BT，随后湖北、安徽、四川、山西等29个省均检出BTV血清阳家畜。目前我国已陆续分离到16个血清型的BTV，其中云南分离并检测到的血清型最多，广东次之[4，5]。新疆已分离到BTV3个血清型。1988年，新疆首次从辽宁盖县调运至克孜勒苏州的绒山羊中检出，1988-1989年对新疆地区牛羊蓝舌病进行普查，结果显示BTV血清阳性畜在新疆广泛存在。2012年，新疆畜牧科学院兽医研究所对疆内的8个地州的8个县市开展蓝舌病调查并在新疆尉犁县监控动物群中分离获得BTV分离株[6]。

蓝舌病病毒粒子呈二十面体对称，基因组大小约20 Kb，无囊膜，有多层衣壳，主要由3部分组成，分别为内部核心、内层衣壳与外层衣壳。该病毒基因组由10个分节段的双链RNA组成[7，8]，可编码7种结构蛋白（VP1-VP7）和5种非结构蛋白（NS1-NS4）。VP2和VP5蛋白构成病毒外壳，其中由L2基因编码的VP2蛋白是主要型特异性抗原，S6基因编码VP5蛋白是蓝舌病唯一糖基化蛋白，与BTV毒力相关。研究表明，VP5能增强VP2中和抗体的产生，能增加VP2的保护作用。对VP5蛋白相关研究可为今后BTV基因工程疫苗的研制奠定基础。我国流行多种BTV血清型毒株，不同血清型BTV毒株对绵羊的致病性存在较大差异，因此BTV不同血清型疫苗的研究，对我国蓝舌病防控具有重要意义。本研究对新疆1株疑似BTV分离株进行PCR鉴定，明确分离株位蓝舌病病毒。应用全长cDNA扩增（full-length amplification of cDNAs，FLAC）技术，获得编码VP5蛋白S6基因序列，同源性比对结果表明，BTV新疆分离株S6基因序列出现较大差异，遗传进化关系可见，新疆蓝舌病分离株与BTV-18血清型及BTV-27血清型关系较近，但并不能归属为蓝舌病血清18型及27型，新疆BTV分离株血清型需进一步鉴定。本研究结果以期为新疆地区蓝舌病防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆蓝舌病病毒分离株、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）均由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。

基因克隆载体PMD18-T、一步法反转录PCR试剂盒（Prime ScriptTM one step RT-PCR kit）均购自TaKaRa宝信生物工程（大连）有限公司，反转录试剂盒（SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System）购自Invitrogen公司，引物合成及测序服务由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 蓝舌病分离株的NS1片段RT-PCR扩增

依照OIE手册提供引物进行巢式PCR，第一轮扩增引物:FA（5’-3’）:GTTCTCTAGTTGGCAACCACC;RB:（5’-3’）:AAGCCAGACTGTTTCCCGAT;第二轮扩增引物FC（5’-3’）:GCAGCATTTTGAGAGAGCGA;RD（5’-3’）:CCCGATCATACATTGCTTCCT，扩增产物片段分别为272 bp和101 bp。取BTV新疆分离株提取RNA 5μL，95℃变性5 min为模板，RT-PCR反应体系25μL，其中模板5μL，2×1 step Buffer（Dye plus）12.5μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，上游引物FA（10μM）0.5μL，下游引物RB（10μM）0.5μL，ddH2O补足25μL。第一轮扩增反应程序：45℃40 min，94℃2 min，1个循环；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s共40个循环；72℃延伸5 min。以第一轮扩增产物为模板，进行第二轮扩增，反应体系为25μL，其中模板1μL，PCR mix 12.5μL，上游引物FC（10μM）1μL，下游引物RD（10μM）1μL，ddH2O补足25μL。反应程序：94℃预变性1 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃20 s共35个循环，72℃延伸5 min，扩增产物送上海生工测序。

1.2.2 分离株S6基因序列扩增

根据FLAC（Full-Length Amplification of cDNA）方法[9]，将BTV新疆分离株接种BHK-21细胞大量培养，离心收集病毒液200μL，加入20μLRNase A和5μL冷核酸酶，37℃处理24 h；提取分离病毒dsRNA，按照T4 RNA连接试剂盒操作方法将病毒dsRNA与Anchor Primer连接，Anchor Primer：5'p-GACCTCTGAGGATTCTAAAC/iSp9/TCCAGTTTAGAATCC-OH-3’；连接产物经RNA试剂盒纯化；取纯化后dsRNA15μL，94℃变性5 min，立即冰浴，按反转录试剂盒PrimeScriptⅡHigh Fidelity RT-PCR Kit说明书，反转录纯化后dsRNA，反应条件30℃10 min，42℃1 h，70℃10 min；分离病毒反转录cDNA中加入0.5μL的RNase H，37℃反应2 h；分离病毒基因组PCR扩增，扩增引物5-15-1 Primer：5'-GAGGGATCCAGTTTAGAATCCTCAGAGGTC-3'，扩增体系为25μL，其中5×Prime STAR GXL Buffer 5μL，DNTP（2.5mM）2μL，5-15-1 Primer 1μL，Prime STAR GXL DNA Ploymerase 1μL，分离病毒cDNA 13.5μL，ddH2O补足25μL，反应条件94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，68℃4 min，30个循环。扩增产物经1.0%琼脂糖电泳，观察结果。

1.2.3 BTV分离株S6基因序列进化树绘制

选取Genbank中已发表BTV1-28血清型（除BTV-14及BTV-15）S6基因片段序列，经MEGA5.0软件Neighbour-Joining（NJ）方法构建进化树。

2 结果与分析

2.1 新疆分离株NS1片段RT-PCR结果

提取新疆分离株RNA，以其为模板进行巢式PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果可见，巢式PCR产物为101 bp目的条带（见图1），测序结果NCBI Blast比对分析，分离株与GenBank数据库中蓝舌病病毒编码NS1蛋白基因相似性为98.04%，鉴定新疆该分离株为蓝舌病病毒分离株。

图1 分离株NS1片段扩增结果

2.2 分离株S6基因序列分析

FLAC技术对蓝舌病新疆分离株PCR扩增，S6基因序列片段为1 572 bp（见图2），将PCR产物送上海生工测序。

图2 分离病毒FLAC方法基因组PCR扩增

登录NCBI GenBank对测序结果进行同源性Blast比对，结果显示新疆BTV分离株S6基因序列与GenBank发表3株BTV分离株S6序列具有同源性，同源性分别为88.11%，87.35%以及70.92%。应用MEGA5.0软件Neighbour-Joining（NJ）方法绘制进化树，其遗传进化关系可见，新疆地区BTV分离株S6基因序列与BTV-18血清型在同一进化分枝，与BTV-27血清型亲缘关系最近（见图3），其中BTV-27型为2014年在法国首次鉴定。

3 讨 论

除南极洲外，蓝舌病病毒在所有陆地均有发现，该病毒呈世界性分布[10]。我国目前有10个省份（地区）分离到16个血清型的BTV，新疆存在3个血清型[11，12]。蓝舌病病毒是一种虫媒传播疫病，血清型众多，BTV基因片段重组和变异导致了其遗传的多样性，地理环境的差异造成不同地理区域蓝舌病病毒出现特有的突变。研究表明，蓝舌病基因组核苷酸变异在某种程度上可反应BTV的地理起源[13]。S6基因编码的VP5蛋白可增强VP2蛋白诱导产生中和抗体，与VP2蛋白构成病毒的外层衣壳。我国BTV-21血清型S6基因序列分析发现该毒株源于日本，该结果证明我国存在基因重组蓝舌病病毒[14]，给我国蓝舌病防控工作增加了一定难度。对不同地区的易感动物进行蓝舌病有效防控，针对该地区蓝舌病特异的血清型疫苗显得尤为重要。

4 结 论

本研究对新疆分离BTV株的鉴定及S6基因序列分析表明，BTV分离株S6基因序列仅与GenBank中BTV strain XJ1407株、BTV strainMNG2/2016株及BTV-18 strain USA2014/FL株的S6基因具有同源性，且同源性均低于90%，分别为88.11%，87.35%以及70.92%。遗传进化关系结果表明分离株S6基因序列与BTV-18血清型在同一进化分枝，与BTV-27血清型亲缘关系最近，但均不属于蓝舌病血清18型及27型。因此，对新疆分离BTV株需进一步进行血清学中和试验鉴定分析，以期为新疆地区蓝舌病疫苗研究提供科学依据。