鉴别小反刍兽疫病毒野毒和疫苗毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

杨夷平，马春江，杨 康，杨 帆，方先珍

（新疆哈密市动物疫病预防控制中心 新疆 哈密 839000）

小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR）是绵羊和山羊等小反刍动物感染小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引发的一种急性、接触性传染病，死亡率可达90%以上，2007年PPRV传入我国，对我国养羊业影响巨大，我国将其划定为一类动物疫病[1，2]。近年来，随着新疆畜牧业的不断发展和牛羊市场需求量不断扩大，本地牲畜量供不应求，外省牛羊的调入也越来越频繁，导致输入性动物疫情风险也不断升高。目前PPR主要通过疫苗免疫进行预防，单一的通用型病原学检测方法不足以应对临床疫病诊断，本研究建立了可鉴别检测PPR野毒株和疫苗毒株双重荧光RT-PCR方法。

1 材料与方法

1.1 病毒与质粒

PPRV疫苗株购自市售天康生物弱毒疫苗。PPRV野毒株为烟墩检查站调运阳性眼鼻拭子。FMDV病毒O型、A型质粒由河南省动物疫病预防控制中心提供。

1.2 临床样品

羊眼鼻拭子样品20份，均来自烟墩检查站阳性样本。

1.3 主要仪器及试剂

实时荧光PCR仪购自ABI公司；核酸提取仪和核酸提取试剂盒(磁珠法)购自西安天隆科技公司；一步法反转录荧光定量探针试剂盒购自生工生物公司；比较用商品试剂盒来自青岛立见生物科技有限公司的小反刍兽疫病毒野毒株与疫苗毒株双重荧光RT-PCR检测试剂盒(批号：040682101)。

1.4 病毒RNA提取

样品核酸的提取参照磁珠法核酸提取试剂盒说明书，以确诊PPRV阳性眼鼻拭子和PPRV疫苗为阳性对照，DEPC水为阴性对照，用全自动核酸提取仪提取样本总RNA，分别设计6个相同稀释梯度，用DEPC水进行10倍稀释，保存备用。

1.5 引物和探针

经过查阅GenBank中已报道的PPRV疫苗毒株Nigeria75／1和中国野毒株的基因序列，见表1。选取PRRV N基因高度保守区且具有特异性的基因序列为模板，运用BLAST大量比对分析，设计PPRV中国野毒株、PPRV疫苗毒株的特异性引物和荧光探针各一对，由上海生工生物工程有限公司合成引物并标记，具体序列及扩增长度见表2。

表1 本研究查阅的PPRV基因序列

表2 荧光定量RT-PCR引物序列和探针标记

1.6 二重RT-PCR方法的建立

分别以PPRV野毒株和疫苗毒株为检测模板，以一步法反转录荧光定量探针试剂盒说明书优化反应体系，筛选PPRV二重RT-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件，最终确定体系为25μL，其中one step RT-qPCR Probe Mix（2×）12.5μL、RT-enzyme MIX 1μL、F1（10μmol／L）0.5μL、R1（10μmol／L）0.5μL、P1（10μmol／L）0.2μL、F2（10μmol／L）0.4μL、R2（10μmol／L）0.4μL、P2（10μmol／L）0.2μL，RNA模板各2.5μL，补水至25μL，RNase free H2O 4.3μL。反应条件为：55℃反转录15 min；95℃预变性30 S；95℃变性15 S，60℃退火1 min，45个循环。

1.7 特异性试验

利用建立的二重RT-PCR方法分别对小反刍野毒眼鼻拭子、小反刍疫苗株和口蹄疫病毒O型、A型标准株为阳性对照，DEPC水为阴性对照，以验证该方法的特异性。

1.8 敏感性试验

将PPRV野毒株和疫苗毒株的RNA梯度稀释（10-1~10-6），浓度自高到低共6个稀释度作为模板，设立阴性对照，按步骤1.6优化的RT-PCR反应条件进行PPRV野毒株和疫苗毒株的RT-PCR敏感性试验。

1.9 重复性试验

10倍梯度稀释的PPRV野毒株和疫苗毒株RNA，选取2个浓度等量混合，按确定的条件进行二重荧光RT-PCR分析重复性，每个稀释度3个重复分析组内重复性，计算Ct值的变异系数，评估重复性试验。

1.10 应用实验

应用建立的双重荧光RT-PCR检测方法与商品双重荧光RT-PCR检测试剂盒进行比对实验，以野毒株病毒和小反刍疫苗病毒标准株等量混合物为阳性对照，DEPC水为阴性对照，对20份疑似PPRV临床样品进行检测实验。

2 结果分析

2.1 特异性试验

用建立的双重荧光RT-PCR方法对A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、PPR野毒、PPR疫苗毒等疫病核酸进行检测，验证引物的特异性。结果显示FAM通道（蓝色）只检测出小反刍兽疫野毒株眼鼻拭子阳性样本核酸并出现特异性“S”型扩增曲线；TAMRA通道（黄色）只检测出小反刍兽疫疫苗株样本核酸并出现特异性“S”型扩增曲线（图1），其他病毒及阴性对照的检测通道均无特异性扩增，表明本研究建立的方法具有良好的特异性。

图1 双重荧光RT-PCR特异性实验

2.2 灵敏性试验

检测结果表明建立的双重荧光RT-PCR方法可以检测到小反刍兽疫野毒株的最低稀释度为10-3，检测到疫苗株的最低稀释度为10-5（图2，图3）

图2 小反刍野毒株灵敏性实验

图3 小反刍疫苗株灵敏性实验

2.3 重复性试验

选取稀释度为10-2小反刍兽疫野毒株为模板，变异系数为1.5%，选取稀释度为10-3疫苗株为模板，变异系数为1.9%，重复性试验的变异系数均小于2.0%，阴性对照未出现特异性扩增，表明该方法具有良好的重复性，见表3。

表3 荧光定量RT-PCR重复性试验结果

2.4 检测方法的应用实验

本研究建立的双重荧光RT-PCR检测方法判定标准：Ct值小于40，扩增曲线有良好的线性关系（“S”型）则判定为阳性，Ct值大于40的判定为阴性。应用建立的双重荧光RT-PCR方法与商品荧光RT-PCR试剂盒同批检测疑似小反刍样品20份，结果显示，检测出小反刍野毒阳性样品18份，疫苗毒结果都为阴性，两种方法检测结果一致，100%符合。

3 讨 论

据统计，2021年我国农业农村部已发布小反刍兽疫疫情14起，其中11起属于输入性疫情，引起小反刍兽疫发病的原因有很多，长途运输、饲养条件及养殖环境突然改变等因素都有可能发病，各地区受调运动物传播各类动物疫情的风险极大。因此，为加强输入性动物疫情防控，亟需加强动物检疫监督工作，规范跨省、跨地区调运动物活动[3-5]。目前，各地对小反刍兽疫防控手段以疫苗防控为主，另一方面通过实验室高效检出早期感染和隐性带毒者，为小反刍兽疫防控与净化提供一定的帮助[6-8]。

新疆的公路动植物联合检查站作为新疆动物疫病防控的第一道屏障，对于没有临床症状的疫病需要依靠实验室分子病原学检测手段诊断，以高效、快捷的检测手段检出早期感染和隐性病原携带者。实时荧光定量PCR技术，因其操作简单、灵敏度高、重复性好、耗时短、成本相对较低等众多优点，可以为小反刍兽疫防控提供一定的帮助。以降低调运动物疫病传播风险，为调运动物落地监管和小反刍疫情防控提供技术参考[9]。在设计多重荧光RT-PCR体系方法时，首先，目的基因的引物需具有特异性，避免非特异性扩增，引物片段大小控制在20 bp左右，避免引物过长干扰扩增效率。其次，多重反应体系中各引物之间的Tm值差距应控制在2℃以内，保证各引物的扩增效率，因此需特别注意引物和探针的设计、引物探针的浓度、退火温度等[10]。本研究设计的2对特异性引物的Tm值相差仅1.1℃，使得在同样退火温度下各目的片段都能够获得较好的扩增效率。

4 结 论

本研究建立的检测方法在临床样品的检测中与商品试剂盒的检测结果一致，表明检测结果是准确的。商品化试剂是批量产品，双重检测试剂盒中的各种组分已提前混合保存，配制体系便捷，但检测成本较高。而本研究建立的双重RT-PCR方法，使用时可视检测目的进行配制各组分，可单一配制PPR野毒株体系，只需剔除PPR疫苗毒株引物及探针，余量用DEPC水补足体系，可快速检测PPR野毒株；亦可配制双重检测组分用于PPR疫苗株和野毒株感染流行病学调查及潜伏感染调查，检测成本较低，具有较广泛的实际应用前景。