聚多巴胺抑制釉质脱矿及促进再矿化的体外研究

牙釉质脱矿通常被称为釉质白斑（white spot lesions，WSLs）是正畸治疗中最常见的并发症。目前大多数报告显示釉质脱矿的发生率为50% ～70%

。成熟牙釉质主要由六棱柱的羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）晶体组成。在牙齿发育过程中，负责形成牙釉质的成釉细胞在成熟阶段会发生程序性的细胞死亡，釉质一旦受损则不能被生物修复或替换

。因此，需要对正畸致WSLs 进行预防和适当的治疗

。

近年来，多巴胺（dopamine）辅助HA 形成是研究热点，聚多巴胺（polydopamine，PDA）薄膜的存在为合成HA 提供了一种创新的仿生方法

。DA 可以在碱性条件下通过氧化自聚反应在各种形状和材料类型上产生一个PDA 薄膜

。DA 形成的PDA薄膜不仅是一种可用于修饰各种基底表面的简单、通用的材料，而且可以改善生物相容性和亲水性

。PDA 与基质有强烈的共价作用，化学性质稳定，PDA 涂层具有良好的耐久性，可在水环境中长期使用。在Xi 等

的研究中，PDA 涂层在60 ℃的去离子水中浸泡36 d 后仍然稳定，而且亲水性能在长时间的洗涤后仍能保持良好。本实验以DA自聚形成的PDA 为成核中心，通过仿生矿化法诱导生成HA，观察PDA 对离体牙釉质脱矿的抑制作用及在脱矿牙釉质表面诱导HA 生成的情况，为预防和治疗WSLs 提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

多巴胺盐酸盐（北京索莱宝科技有限公司，中国），超声清洗机（KQ5200，昆山超声仪器有限公司，中国），能量色散光谱仪（Hitachi S-4800，日立公司，日本），低速切割机（IsoMet 1000，Buehler Ltd，Lake Bluff IL，美国），扫描电镜（nSM-5600LV，Nicolet，美国），傅里叶变换红外光谱仪（NEXUS 670，乔尔有限公司，日本）。

1.2 人工脱矿液的配置

按表1 配置人工脱矿液，用5.0 mL KOH 调整pH 为4.5，最终以去离子水定容至1 000 mL。

1.3 模拟体液的配置

配置模拟体液（simulated body fluid，SBF），各离子浓度：Na

142.0 mmol/L，K

5.0 mmol/L，Mg

1.5 mmol/L，Ca

2.5 mmol/L，Cl

147.8 mmol/L，HOCO

4.2 mmol/L，HPO

1.0 mmol/L，SO

0.5 mmol/L。以去离子水定容。

1.4 多巴胺溶液的配置

图1a 显示实验组牙釉质表面的PDA 薄膜形貌均匀、光滑、平整。图1b 显示将对照组牙釉质进行脱矿3d 处理后，牙釉质表面形成蜂窝状孔隙，大小一致，同时釉柱结构被溶解破坏。图1c 显示实验组牙釉质脱矿3d 后形成的孔隙较小，零散分布，同时孔隙较浅。图1d ～1f 为脱矿处理后对照组和实验组随之进行再矿化7d 后的SEM 图。图1d 可以看到对照组牙釉质表面有大小不等的絮状矿物质沉积，无具体外形，结晶度差。图1e、1f 图显示实验组的牙釉质表面产生了片状晶粒，生长呈明显方向性，生长规律，排列均匀一致。

1.5 牙釉质标本准备与脱矿处理

本实验已通过兰州大学口腔医学院伦理委员会审批（批号：LZUKQ-2020-037）。收集20 颗新鲜拔除的牛下颌切牙，要求完整无缺损，釉质发育正常。洁牙机去除菌斑色素后自牙颈部截去牙根，切成5 mm×5 mm×1 mm 的釉质切片，共20 片，纱条抛光后备用。将准备好的釉质切片随机分为实验组和对照组，各组10 片，实验组样本悬吊于新鲜配制的多巴胺溶液中，室温，避光下静置24 h，制备PDA 涂层，取出后用去离子水超声清洗20 min，N

干燥；对照组不处理。

企业以及物资采购员自身必须明确其岗位职责以及岗位权限。从企业角度来讲，结合企业自身实际情况定期对采购人员实施轮岗制度，并将采购业务授权以及审核批准制度不断完善，要求采购人员严格按照规章制度开展各项采购业务。企业每一次采购都需要结合企业实际需求而制订，比如，物资采购计划。首先，需要制订合理的物资采购依据以及物资质量标准，这样才能确保物资采购计划与生产相契合；其次，建立并完善监督机制，采购人员在物资采购过程中有必要加强监督力度，并做到动态跟踪，及时发现问题并对物资采购计划进行调整，使其质量与成本都能够得到有效控制，确保采购工作是按照采购计划有效进行的［2］。

将Image-Pro Plus 软件测量的脱矿孔隙直径数据采用SPSS 26.0 统计软件分析数据，使用配对

检验，

＜0.05 认为差异有统计学意义。

1.6 牙釉质再矿化实验

图3 是多巴胺样品、实验组24 h 牙釉质沉积物和实验组再矿化7 d 后牙釉质沉积物的FTIR 光谱图。24 h 牙釉质沉积物的光谱中可以看到3 283 cm

处出现较宽的峰，这是因为O-H 和N-H 的伸缩振动叠加形成的，1 644 cm

处的峰是苯环上C=C键的伸缩振动，1 515 cm

处的峰是N-H 的剪切振动，以上结果证明本实验在牙釉质上成功制备出PDA 涂层。再矿化7 d 后牙釉质沉积物的光谱中可以看到3 572 cm

处为O-H 的特征性吸收峰，1 089 cm

处为PO

的伸缩振动峰。3 572 cm

处的峰属于HA 中的O-H 基团，1 089 cm

处的峰属于HA 中的PO

基团，以上FTIR 结果证明再矿化7 d后牙釉质表面沉积物的主要成分为HA。

1.7 表征

用扫描电子显微镜（scanning slectron microscope，SEM）观察釉质表面形貌，将脱矿3 d 的SEM图导入Image-Pro Plus 软件，测量所有脱矿孔隙直径。通过能量色散光谱仪（energy dispersive spectroscopy，EDS）分析釉质表面钙磷比。用傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）探寻沉积物中的特征官能团。

两种性别基因表达平衡的不断进化，导致表型的性别均衡，掩盖了细胞机制的性别偏差。平衡可能是由选择压力驱动的，该选择压力确保化学计量的X：A比例在男性、女性的相似性，使得XX和XY细胞均在适当的细胞功能的限度内工作。但任何表型的性别均等仅仅是可能的，因为XX和XY细胞各自执行不同的功能，即，用不同的分子机制来调整其基因组的差异。XX细胞必须调整其基因组/表观基因组系统，使之可以与XY细胞以不同的方式正常工作。这使得性别平衡是暂时的，因为细胞环境中的任何扰动(例如由年龄、环境毒素和产生肿瘤的突变引起)可以影响这一平衡，导致疾病的性别差异，而这在健康细胞中不存在。

1.8 统计学分析

据业内人士介绍，全球有60个已发生过非洲猪瘟疫情的国家中，迄今只有13个国家根除了疫情，根除时间多为5至36年。比如俄罗斯从2007年首次发生非洲猪瘟至今已经有11年，共发生疫情超过1000起，但仍没有得到有效控制。由此可见，防控非洲猪瘟将是一个长期战役，其对猪肉乃至食品整体价格的影响也将持续。

2 结 果

2.1 SEM 观察脱矿处理后釉质表面形貌

称取0.12 g 的多巴胺，去离子水定容，配置2 mg/mL 多巴胺溶液共100 mL，溶解温度设为37 ℃，转速800 r/min。完全溶解后，用10 mmol/L Tris-HCl 缓冲液调整pH 值至8.5。

由于遗传、环境和年龄因素的影响，不同人牙的成分和结构是具有差异的，而牛牙与人牙的化学成分最相似，有几乎相同的Ca、P 含量、釉质厚度、以及相似的耐酸能力

，同时，牛牙可以标准化牙齿的大小和年龄，其宽大、平坦的釉质表面也更利于操作。因此本研究选择在体外离体牛牙釉质上，以PDA 为成核中心，通过仿生矿化法诱导生成HA。

2.2 EDS 分析脱矿后釉质表面Ca/P 比

图2 为两组脱矿后釉质表面的EDS 图。根据EDS 得到的元素含量计算得出，对照组在牙釉质表面进行脱矿3 d 后的Ca/P 比为2.53，而实验组PDA薄膜牙釉质脱矿3 d 后的Ca/P 比为2.37，低于对照组，更接近标准HA 的Ca/P 比（1.67）。

2.3 FTIR 分析牙釉质沉积物中的特征官能团

将脱矿后剩余的实验组和对照组牙釉质切片各5 片，分别浸泡于新鲜配置的SBF 中，置于37 ℃的恒温箱，每天更换一次SBF，诱导脱矿牙釉质发生再矿化。持续浸泡7 d 后取出，用去离子水温和地超声清洗20 min，再用流动的去离子水漂洗，室温下干燥，表征备用。

3 讨 论

牙在口腔中不断经历脱矿和再矿化的循环，在遇到酸性物质后，牙齿中的矿物质流失被称为脱矿，而将这些矿物质恢复到牙齿结构中被称为再矿化

。正畸过程中过大的酸蚀范围、残留的粘接剂、不良的口腔卫生等会打破这种动态平衡。WSLs 被定义为局部的釉质脱矿区，最早可在正畸治疗开始后4 周内发生

。虽然唾液可以在一定程度上使WSLs 再矿化，但这种作用是有限的

；也并非所有的病例都能出现这种恢复

。

目前WSLs 的预防和治疗主要分为微创手段和创伤性治疗手段。微创手段中氟化物的应用与研究相对较多。含氟牙膏和含氟漱口水需要正畸患者在口腔健康定期维护的基础上使用，有证据表明正畸患者每天使用含氟漱口水的依从性只有13%

。氟保护漆的使用有一定局限性，高浓度的氟会阻止深层釉质再矿化；高频次应用氟化物会使变形链球菌产生耐氟菌株。除了氟化物，近年来酪蛋白磷酸多肽-无定形磷酸钙（casein phosphopeptide-amorphic calcium phosphate，CPP-ACP）成为了研究热点。有研究表明与普通氟化物牙膏相比，CPP-ACP 在改善表面病变的严重程度和活性方面没有差别

。同时CPP-ACP 使用后，没有观察到脱矿釉质微硬度或再矿化的重大变化。WSLs的创伤性治疗方法主要有微研磨、牙齿漂白、渗透树脂技术和美白贴面修复。有研究显示微研磨无法避免釉质结构中钙、磷的流失，在去除釉质表层的同时会将钙离子、磷离子压入釉柱间隙，从而导致微研磨后的釉质折光率发生改变甚至会加重WSLs 的白垩色

。牙齿漂白的副作用最主要的是牙齿敏感问题，临床应慎用。渗透树脂技术近年来开始应用于临床，但由于口腔环境的挑战，树脂修复材料的寿命仍然是一个主要问题。老化过程、刷牙和饮用有色饮料会影响WSLs 的颜色稳定性和表面粗糙度

。因此，需要寻找一种在促进牙釉质再矿化的同时能抑制牙釉质脱矿的简单有效方法。

贻贝的斑块内含有高浓度的3，4-二羟基苯丙氨酸（dihydroxyphenylal- anine，DOPA），而DOPA 最独特的结构是含有儿茶酚基团。DA 是DOPA 的一种非常重要的衍生物，同时是一种常见的神经传递物质，近年来引起了研究者的重视和广泛关注。Lee 等

将DA 溶在生物缓冲剂三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中，调整pH 值为8.5，其中浸泡不同的材料，有氧条件下静置24 h，最终得到了厚约50 nm的PDA 薄膜，强酸浸泡和超声震荡后PDA 薄膜仍存在，且黏附性良好。DA 静置24 h 后形成的PDA薄膜几乎可以附着在任何固体材料表面，例如金属、贵金属、半导体和各类合成高分子材料。近年来，DA 辅助HA 形成的研究不断涌出，PDA 薄膜的存在为仿生矿化法合成HA 提供了一种创新的仿生方法。

37 ℃恒温箱中，将两组样本在人工脱矿液中浸泡3 d，诱导牙釉质脱矿，每天更换一次人工脱矿液。取出后，用去离子水温和地超声清洗20 min，再用流动的去离子水漂洗，室温下干燥，取实验组和对照组牙釉质切片各5 片作为表征材料。

脱矿处理3 d 后，对照组牙釉质表面产生的孔隙直径为（4.21 ± 0.71）μm，实验组孔隙直径为（2.09 ± 0.48）μm，两组差异具有统计学意义（

=19.392，

＜0.001）。

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目前对于PDA 薄膜结构特征和特性的表征方法主要有化学光谱法（核磁共振波谱、紫外-可见分光光度法、拉曼光谱、傅里叶变换红外光谱）和质谱分析法（飞行时间质谱、电喷雾质谱、飞行时间二次离子质谱）

。傅里叶变换红外光谱由于其扫描速度快、分辨能力高、所需样本少，常被用于测定各种材料和粘合剂性能

。因此本研究选用SEM 进行表面形貌观察，用FTIR 进行PDA 薄膜结构的表征，用EDS 对比HA 晶体结构中的Ca/P 比。结果显示，与对照组相比，实验组的牙釉质脱矿3 d 后形成的孔隙较小，差异具有统计学意义。同时EDS 结果显示脱矿3 d 后对照组的Ca/P 比为2.53，而实验组的Ca/P 比为2.37，实验组Ca/P 比更接近标准HA 的Ca/P 比（1.67）。Ergun 等

提出不同Ca/P 比的HA 晶体结构和性能差异很大，越接近标准计量比的HA 晶体结构越完整，性能越稳定，而越偏离标准计量比的HA 晶体结构缺陷越大，越不稳定。以上结果说明PDA 可以抑制牙釉质脱矿过程的Ca、P 离子流失和釉柱结构的破坏。

再矿化实验中，对照组再矿化7 d 后的SEM 图可以看到牙釉质表面有大小不等的絮状矿物质沉积，无具体外形，结晶度差；而实验组的牙釉质表面产生了片状晶粒，生长呈明显方向性，生长规律，排列均匀一致。这可能归因于PDA 的儿茶酚基团在SBF 中表现出高的钙离子配位能力，并能促进各种基质上HA的形成

。EDS结果中再矿化7 d后实验组Ca/P 比为2.37，小于对照组的2.53，更接近标准计量比。FTIR 结果证明再矿化7 d 后实验组牙釉质表面沉积物为HA。以上结果说明PDA可以加速Ca、P 离子沉积，辅助生成HA。此外很多材料疏水性的表面限制了仿生矿化的应用，而PDA 作为一种亲水改性剂，改善了基底的湿润性，可以提高基底的生物矿化能力

。

再次，能够多角度的呈现事物。信息技术能轻松实现事物的伸缩、定格、整体和局部等，利于幼儿观察，幼儿观察的越广泛、深刻，在大脑中留下的表象就越丰富、清晰，丰富的表象有助于幼儿想象力的发挥，从而提高幼儿的创造力。

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综上，PDA 涂层对WSLs 有抑制作用，能减少釉质表面Ca、P 离子的流失。同时可以影响HA 的成核过程，促进脱矿釉质表面生成HA。PDA 为预防和治疗WSLs 提供了一种新的思路。

【

】 Zeng T performed the experiments and wrote the article. Chen WYF, Zhang GR, Liu YN and Yang YX performed the experiments and revised the article. Cao BC designed the study and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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