单侧SOM患者中耳积液中胰蛋白酶和胃蛋白酶检测结果分析*

徐冰 王采集 陈敏 李宛桐 张世丽 赵泽祺 乔月华

近年来，多项研究[1～4]表明，咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux disease,LPRD)与分泌性中耳炎(SOM)之间存在相关性，SOM多伴随LPRD。国内[5,6]、国外[7,8]的研究者们在SOM中耳积液中检测到了胃蛋白酶，且浓度是血清中浓度的百倍，推测胃蛋白酶可能来源于咽喉反流性疾病。目前，LPRD加重SOM的发病机制尚未完全阐明，主流学说有中耳负压学说[9]、感染学说[10]、细胞因子学说[11]等。LPRD的反流物包括胃蛋白酶、胃酸、胆汁酸和胰酶等，胃蛋白酶仅在pH酸性的环境下才具有活性[12]，而胰蛋白酶最适pH值在7.8～8.5，在强酸环境中几乎不失活；中耳腔为中性环境，理论上，在中耳腔，胰蛋白酶比胃蛋白酶更容易发挥作用，造成粘膜损伤；然而，尚无研究检测SOM中耳积液中是否存在消化作用更强的胰蛋白酶。反流症状指数评分量表(reflux symptom index, RSI)为临床诊断LPRD最常采用的手段[13]。故本研究使用免疫印迹实验(western blot, WB)验证SOM患者中耳积液中是否存在胰蛋白酶和胃蛋白酶，用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进一步检测其浓度；并对SOM患者进行RSI量表评估，初步探讨成人分泌性中耳炎的中耳积液中是否存在胰蛋白酶和胃蛋白酶，并分析其在SOM合并LPRD诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1研究对象 以2019年1月～2020年1月经徐州医科大学附属医院耳鼻咽喉科确诊的40例单侧SOM患者为研究对象，年龄25～60岁。入选标准：所有受试者均接受纯音测听、声导抗、耳镜检查以及中耳积液细菌培养，鼓室导抗图为B型，耳内镜下见鼓室积液征，且中耳积液细菌培养3天结果为阴性，诊断为单侧SOM。排除标准：中耳积液细菌培养结果阳性、2周内服用过抑酸药物，有胰腺炎、慢性化脓性中耳炎、鼓膜穿孔、耳部肿瘤、鼻咽癌等疾病者。

1.2中耳积液标本采集和pH值测试 所有对象均抽取患耳中耳积液，方法：患耳朝向术者，清理外耳道，外耳道用75%乙醇消毒。将浸有1%的丁卡因的薄棉片仔细地贴敷在外耳道皮肤及鼓膜上，保持10分钟。以7号针头于鼓膜前下象限做穿刺，缓慢抽吸鼓室积液，迅速取一部分进行细菌培养和pH值测试，剩余部分置于2 ml无菌冻存管内，-80 ℃保存备用。

1.3免疫印迹实验(WB)及酶联免疫吸附测试(ELISA) WB验证中耳积液中是否存在胰蛋白酶与胃蛋白酶，ELISA进一步检测样本中胰蛋白酶与胃蛋白酶浓度。

WB：抗体购自中国上海-Abcam公司。离心管预冷，样品解冻后，取部分样本至预冷离心管内，加入蛋白酶抑制剂及裂解液，于冰上裂解半小时。离心(12 000 r/min，4℃，5 min)后取上清至新的预冷无菌管内，加入loading buffer，混匀，100 ℃煮沸10 min；将制作好的样品加入样品孔，依次进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显影。

ELISA：ELISA试剂盒购自中国武汉-武汉云克隆科技股份有限公司。按照ELISA试剂盒说明书，样品加入样品孔后，37℃温箱孵育1小时，然后加入显色剂显色，终止液终止反应，依序测量各孔的吸光度(OD值)，根据标准曲线的直线回归方程式，计算样品中胃蛋白酶及胰蛋白酶浓度。

1.4RSI量表评估和填写基本情况调查表 所有受试者均需完成基本情况调查表填写和反流症状指数评分量表(reflux symptom index, RSI)评估。基本情况表包括患者年龄、性别、病程，近期药物使用情况、既往史等。患者对RSI量表中的每项症状严重程度进行自我评分，为尽量减少主观因素影响，指引填写的医师为同一人；RSI评分>13分为阳性。

1.5统计学方法 采用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析。计量资料均经Shapiro-Wilk检验，正态分布的资料以均数±标准差表示，样本间比较采用独立样本t检验。非正态分布资料以中位数及25%、75%四分位数(QL，QU)表示，样本间比较采用Mann-Whitney检验；检验水准α取0.05。

2 结果

2.1WB结果(图1) 40份单侧SOM患者的中耳积液样本中，24份(60.0%)检测到胰蛋白酶，在这24份样本中，100%(24/24)同时检测到了胃蛋白酶。31份样本中(77.50%)检测到胃蛋白酶，其中，77.42%(24/31)同时检测到胰蛋白酶。

2.2ELISA结果 24份胰蛋白酶阳性的中耳积液样本进行胰蛋白酶ELISA检测，31份胃蛋白酶阳性的中耳积液样本进行胃蛋白酶ELISA检测，结果经Shapiro-Wilk检验，均为非正态分布，故以中位数及四分位数(QL，QU)表示。

24份胰蛋白酶阳性的中耳积液样本中，胰蛋白酶浓度为270.81(201.02，377.56)ng/mL，范围为62.16～965.64 ng/mL；31份胃蛋白酶阳性的中耳积液样本中，胃蛋白酶浓度为65.28(59.29，80.82)ng/mL，范围49.39～134.68 ng/mL，胃蛋白酶浓度显著低于胰蛋白酶浓度(P<0.0001)。

2.3pH值检测结果 40份中耳积液pH值为6.2～8.3，平均7.15±0.61。

2.4RSI量表评估结果 40例单侧SOM患者中，12例(30.0%)RSI评分为阳性，其中83.33%(10/12)中耳积液样本中检测到胰蛋白酶，100%(12/12)样本中检测到胃蛋白酶。RSI量表阳性患者样本中胰蛋白酶和胃蛋白酶检测阳性率及浓度，与总体样本之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

研究者[5～8]在SOM患者的中耳积液中检测到了胃蛋白酶原或胃蛋白酶，推测SOM患者中耳积液中的胃蛋白酶可能来自于LPRD。本研究结果显示，除了胃蛋白酶以外，部分SOM患者的中耳积液中还检出了胰蛋白酶；而且，在胰蛋白酶阳性的样本中，同时都检测到了胃蛋白酶；反之，只有部分胃蛋白酶阳性的样本中检测到了胰蛋白酶。考虑原因是胰蛋白酶存在于胰液中，主要分布在小肠，胃蛋白酶存在于胃液中；LPRD反流物主要为胃内容物，含有胃酸和部分胃蛋白酶，可能携带或未携带紧邻的十二指肠中的胰液。

本研究结果中RSI量表阳性的12例样本中，胰蛋白酶与胃蛋白酶的阳性率和浓度与总体样本无显著性差异(P>0.05)，有可能需要扩大样本量进一步观察分析；但说明部分SOM合并LPRD的患者未表现出LPRD临床症状，这也与其他学者研究结果相符(Hogan,2000;Lieu,2005)。WB结果显示，40例SOM患者中24例(60.0%)样本检测到胰蛋白酶，31例(77.50%)样本检测到胃蛋白酶，考虑合并LPRD，而其中仅有12例(30.0%)RSI量表评分为阳性，即表现出LPRD的临床症状。故可能有部分合并LPRD患者，由于缺乏临床表现，导致漏诊LPRD。对于这部分患者，在取出中耳积液的同时，可进行胰蛋白酶、胃蛋白酶的检测，以明确LPRD诊断，早期进行抑酸治疗。

胰蛋白酶的最适pH值为7～8，胃蛋白酶的最适pH值为1.8～3.5，且当pH值超过5时，胃蛋白酶完全失活[13]；本研究40份中耳积液pH为7.15±0.61，更接近于胰蛋白酶的最适pH值。ELISA结果表明，24份胰蛋白酶阳性的中耳积液样本中，胰蛋白酶浓度为270.81 ng/mL，31份胃蛋白酶阳性的中耳积液样本中，胃蛋白酶浓度为65.28 ng/mL，胃蛋白酶浓度显著低于胰蛋白酶浓度(P<0.0001)，进一步说明中耳腔的pH环境更适合胰蛋白酶，此环境中，已被激活的胰蛋白酶可进一步激活胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶从而被检测到，而胃蛋白酶原则会进入失活状态[12]。但本研究样本量较少，此结论还需扩大样本量进一步研究证实。