多壁碳纳米管分散固相萃取-液相色谱串联质谱法测定鸡肉中26种农药残留

吕佳宁 丁葵英 郭礼强 许文娟 田国宁

1.潍坊医学院公共卫生与管理学院 山东潍坊 261043

2.潍坊海关 山东潍坊 261041

近年来，随着生态循环，农药也不断污染动物源性食品，各国都不断增加动物源性食品中农药残留限量种类和降低限量值。GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》也对部分农药残留限量作了规定[1]。鸡肉中因含有脂肪、蛋白质等，所以测定其中的农药残留相对复杂，传统的农药残留检测净化方法操作繁琐、试剂消耗量大、污染严重等，这些方法逐渐被当前流行QuEChER(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe)法所取代，该法因可有效提高工作效率，降低环境污染[2～4]，被广泛应用于食品中的农药残留检测。在QuEChER法中吸附剂材料的性能，直接制约着农药残留测定方法的效率，所以新型高效吸附净化材料的制备和应用是近年来研究的热点[5,6]。多壁碳纳米管(multi walled carbon nanotubes,MWCNTs)是近年来逐渐流行的新型纳米吸附材料，它是由多层六角碳网层面卷成的同轴圆筒状的碳纳米管[7]，由于其独特的优势结构和物理化学性质，如大比表面积、易于功能化等[8～11]，使其对有机物具有很强的吸附能力和选择性，因此增加了对色素、脂肪等干扰物的选择性[12,13]，并且通过表面去活技术，控制了材料对药物的过分吸附，保证了敏感性农药的回收率，故被广泛应用到禽肉[14]、土壤[15]和茶叶[16]中的农药残留分析。近年来，液相色谱-串联四极杆质谱联用(LC-MS/MS)技术由于兼具液相色谱的分离能力和串联质谱的高灵敏度、高专属性特点[17]，逐渐成为农药残留分析的有效手段。鸡肉中同类多农药残留同时测定虽有报道[18,19]，但对于不同种类的多农药残留同时测定报道较少。

试验采用MWCNTs净化技术联合超高效液相色谱-串联四级杆质谱(HPLC-MS/MS)分析手段，同时测定鸡肉中氨基甲酸之类、有机磷类、菊酯类等26种代表性农药的残留量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司);

甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；

无水硫酸镁(分析纯，纯度95%，天津市光复精细化工研究所，使用前在500℃马弗炉内烘5h，20℃时取出冷却备用)；

C18粉、PSA粉(Agela technologies inc公司)；

灭蝇胺、乙酰甲胺磷、涕灭威亚砜、涕灭威砜、久效磷、内吸磷-S-亚砜、内吸磷-S-砜、涕灭威、乙拌磷亚砜、乙拌磷砜、氯吡脲、氯虫苯甲酰胺、亚胺硫磷、嘧菌酯、乙拌磷、氟甲腈、除虫脲、氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、丙溴磷、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟啶脲、溴氰菊酯标准品(乙腈中1 000μg/mL，北京坛默有限公司)；

长多壁碳纳米管(LMWCTNS,外径为5～15nm,长度为10～30μm，先丰纳米公司)和短多壁碳纳米管(SMWCNTS,外径为5～15nm,长度为2～10.5μm，先丰纳米公司)。

鸡肉样品来自于报检公司报检样品。

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源(ESI)(安捷伦6470QQQ，美国Agilent公司)；

碾磨仪(GM 200，德国RETSCH公司)；

高速分散均质器(IKA-T25，德国IKA公司)；

电子天平(PB403-S，瑞士Mettler公司)；

离心机(Eppendof 5810R，德国Eppendof公司)；

涡流混匀器(MS3 basic，德国IKA公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

1.3.1.1 混合标准储备液配制

分别准确移取100μL的1 000μg/mL的液体标准溶液(灭蝇胺、乙酰甲胺磷、涕灭威亚砜、涕灭威砜、久效磷、内吸磷-S-亚砜、内吸磷-S-砜、涕灭威、乙拌磷亚砜、乙拌磷砜、氯吡脲、氯虫苯甲酰胺、亚胺硫磷、嘧菌酯、氟甲腈、除虫脲、氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、丙溴磷、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟啶脲、溴氰菊酯标准品)和50μL的1 000μg/mL乙拌磷液体标准品于10mL的棕色容量瓶中，用乙腈稀释定容，配制成乙拌磷为50μg/mL和其他25种标准品为10μg/mL的混合标准储备液，于-18℃下存放。

1.3.1.2 基质匹配标准溶液的配制

移取上述混合标准溶液50μL，用空白鸡肉基质提取溶液定容至1mL，得乙拌磷为2.5μg/mL和其他农药0.5μg/mL标准中间液。精密移取标准中间溶液，用空白样品基质溶液配制成其他农药为0.005～0.1μg/mL，乙拌磷为0.025～0.5μg/mL的系列混合标准工作溶液，现用现配。

1.3.2 实验方法

称取10g试样(精确至0.01g)于80mL离心管中，加入10mL乙腈，用高速组织捣碎机在15 000r/min，匀浆提取1min，加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠，再匀浆提取1min，在5 000r/min离心5min，定量吸取上清液2mL至内含无水硫酸镁450mg，10mg多壁碳纳米管粉末的塑料离心管中，涡旋混匀1min,5 000r/min离心5min，吸取上清液过微孔滤膜后进行液相色谱-串联质谱测定。

1.4 LC-MS/MS条件

1.4.1 LC条件

色谱柱为SB-C18(3.0×100mm，2.7μm)；柱温为40℃；进样量为1μL；流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序：0～1min，5%B；1～4min，5%～60%B；4～14min，60%～100%B；14～18min，100%B；18～18.1min，5%～100%B；18.1～21min，5%B。流速0.4mL/min，运行21min.

1.4.2 MS条件

离子源为ESI；扫描方式为正负离子同时扫描；检测方式为动态多反应检测(dMRM)；干燥气温度为350℃；干燥气流速为11L/min；雾化气压力为40psi。毛细管电压为正4 000v，负2 500v，其他参数见表1所示，26种化合物0.01ug/mL基质标准总离子流图如图1所示。

表1 26种农药的质谱分析参数

续表1

图1 26种化合物0.01ug/mL基质标准总离子流图

2 结果与讨论

2.1 上机条件的建立

液相色谱-串联质谱法进行农药残留测定的方法不仅关系到目标化合物的分离度，同时也严重影响仪器灵敏度，所以建立合适的上机方法非常重要。试验发现在水相中加入甲酸可以显著提高26种化合物的响应值，同时对比了甲醇和乙腈2种有机相对目标分析物响应值的影响，发现甲醇作有机相各化合物的响应值更好，试验经过反复摸索确定了1.4所述流动相比例梯度和流速，应用该方法26种化合物的色谱峰峰形和分离度都很好。

各化合物的质谱参数参考安捷伦公司提供的药品测定参数库，但该参数库缺少氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈硫脒等几种化合物条件。采用以1μg/mL的单一标准溶液不接色谱柱直接进样全扫描方式进行扫描，选择离子信号强的特征离子作为母离子，进行产物离子扫描，将目标农药的母离子打碎，选择响应值高的2个离子作为子离子，然后进行碎裂电压、碰撞能量等参数的优化，最后建立动态多反应监测(dMRM)模式，各质谱参数见表1。dMRM模式避免了对多种化合物同时测定时通道分离的麻烦，有效提高各化合物的灵敏度。

2.2 吸附剂净化能力的对比

农药残留分析需要一种有效的净化方法，特别是脂肪含量较高的鸡肉基质，为选取有效的吸附剂，本研究评价了长短两种MWCNTs(10mg和60mg)、PSA和C18(各75mg)混合粉末的净化效果。经过PSA和C18(75mg)组合后的样品提取液，远不如经过两种MWCNTs净化后的样品，经MWCNTs净化后样品去脂效率较好，同时LMWCNTs净化后的样品更加干净。此外，从回收率看，8种物质经LMWCNTs净化后回收率高于经SMWCNTs净化后的样品，特别是灭蝇胺，回收率高出25.8%；虽经SMWCNTs净化后的样品也有8种目标化合物高于SMWCNTs净化后的样品，但高出最多不超过10%，其他几种化合物回收率两种MWCNTs净化后目标化合物回收率基本相同，这可能因为决定MWCNTs吸附能力大小的主要因素是外径尺寸[20]，而这2种MWCNTs的外径尺寸相同，只是长度不同，所以对基质的净化能力相差不大。综合考虑26种化合物的回收率和净化效果，选用LMWCNTs测定过程中的净化吸附剂。

2.3 吸附剂用量的优化

为了评估吸附剂用量的影响，研究了不同用量的吸附剂对回收率和净化程度的影响。吸附剂材料从5mg逐渐增加到60mg。实验使用2mL乙腈提取物，加标水平为0.04mg/kg，放入含有450mg硫酸镁和不同数量的LMWCNTs(即5、10、15、30、60mg)的10.0mL离心管中。随着LMWCNTs含量的增加，当LMWCNTs的含量从5mg增加到15mg时，26种目标化合物的回收率保持在一个相对恒定的水平(70.9%～96.7%)，回收率均在可接受的70%～110%范围内；然而，随着LMWCNTs用量的增加，在15～60mg范围，乙酰甲胺磷、氯吡脲、氯虫苯甲酰胺、除虫脲、苯醚甲环唑、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和氟啶脲回收率下降到70%以下，这可能由于LMWCNTs易吸附含有苯环平面结构的农药造成的[21]。此外，虽然5mg或者10mg吸附剂某些化合物获得了更好的回收率，但净化能力不如15mg，使用时有更多的色谱干扰。在LMWCNTs用量为15mg时，回收率也可以接受。因此，使用15mg(3mL提取物)作为净化剂的最佳量。吸附剂用量对回收率的影响见图2所示。

图2 吸附剂用量对26种目标化合物回收率的影响

2.4 基质效应

为使26种化合物同时测定时定量结果更加准确，日常检测中使用基质标准进行定量，各化合物的基质效应值见表2。

表2 26种目标化合物的基质效应(ME)、线性方程、R2、LOD和LOQ

基质效应干扰目标化合物的电离，导致离子响应值增强或抑制，这对定量结果起着重要作用。为了确定基质效应，我们将基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值(ME)作为评估基质效应的大小，其中值在0.9～1.0表示基质效应较小可忽略不计，值小于0.9时，为基质抑制效应，值大于1.1时，为基质增强效应[22]。当使用15mg的LMWCNTs净化基质时，只有6种物质不受基质效应影响，3种物质氟虫腈、氟甲腈和氟虫腈硫脒表现出基质增强效应，特别是氟虫腈和氟虫腈硫脒其值为1.63和1.41；除虫脲、丙溴磷、氟啶脲、涕灭威、溴氰菊酯、乙拌磷表现为较强的基质抑制效应，其他9种物质表现出相对较弱的基质抑制效应，其值在0.8～0.9之间。基质效应可能与化合物电离方式有关，氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈硫脒和氟虫腈砜为负离子扫描模式，表现出基质增强效应或不受基质效应影响，其他物质为正离子扫描模式，大部分物质表现为基质抑制效应；其次，基质效应与目标化合物分子结构密切相关，分子结构中含有磷酸(-PO)、羟基(-OH)、偶氮(-N)、氨基(-R-NH-)、羧基(-COOH)、氨基甲酸酯(-O-CO-NH-)和尿素(-NH-CO-NH-)的化合物最容易受基质效应的影响[23]。同一类化合物的ME值非常接近，如嘧菌酯和吡唑醚菌酯、涕灭威砜和涕灭威亚砜。

2.5 方法验证

2.5.1 线性、定量限和检出限

使用鸡肉空白基质提前液，配制系列浓度标准溶液0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.10μg/mL，通过测定标准溶液浓度响应值，以待测物质的峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标进行线性拟合，绘制标准曲线，计算每种农药的测定系数(r2)的线性值。结果表明r2值皆大于0.99，表明25种药物均在在0.005～0.1μg/mL和乙拌磷0.025～0.5μg/mL在浓度范围内线性关系良好。在实际测定中，如超出该范围，可进行适当稀释或浓缩。

为计算该方法的检出限(LODs)和定量限(LOQs)，配制26种化合物系列浓度的单一基质标准溶液，每种化合物每个浓度设5个平行，然后以3倍信噪比(S/N)计算检出限和10倍信噪比(S/N)计算定量限，各化合物的检出限和定量限见表2。由表2可知：其中乙拌磷和溴氰菊酯的检出限和定量限相对较高，但乙拌磷在食品中最大限量标准规定，乙拌磷及其氧化物和硫醇化合物总和以乙拌磷计，溴氰菊酯在国内外限量标准中，最低残留限量为0.01mg/kg，所以该方法能很好的满足国内外限量标准要求。

2.5.2 准确度和精密度

为了验证方法的准确性和重复性，对阴性样品进行加标实验，为考虑26种物质的同时添加，所以添加浓度选择0.01mg/kg、0.02mg/kg和0.1mg/kg，每个样品重复测定8次，计算各化合物的回收率和精密度。所有农药的回收率均在70.9%～106.7%，相对标准差(RSD)均低于1.3%～11.4%。说明该方法具有良好的准确性和精密度，可以满足鸡肉中26种药物同时检测的要求。

2.6 实际样品测定

从报检的20份鸡肉样品中，测定26种化合物，其中一份检出涕灭威亚砜9.0μg/kg，一份检出溴氰菊酯15.0μg/kg，但都没有超出国内外残留限量的要求。

3 结论

采用LMWCNTs净化技术，联合超高效液相色谱-四级杆串联质谱联用方法，建立了鸡肉中26种农药化合物残留量的检测方法。通过进行方法学评价，证明各组分基质标准溶液在0.005～0.1μg/mL浓度范围内线性关系良好，平均回收率均在70.9%～106.7%，相对标准偏差均小于或等于11.4%。因此，本方法用于鸡肉中26种农药化合物残留的检测，具有准确、快速、简便、吸附剂用量少、灵敏度高等优点，用于日常批量检测可大大降低检测成本，提高检测速度，解决检测鸡肉样品时易出现的干扰问题，满足当前国内外不断更新的鸡肉中26种农药残留限量的标准要求。