黄芩素对脓毒症大鼠的治疗作用及机制

杨丽， 陈卫， 华丽， 吕秀华

（济南市人民医院，山东济南 271100）

脓毒症（sepsis）是指因感染引起的宿主反应失调导致全身多脏器功能障碍的临床综合征[1]。脓毒症是严重的烧（创）伤、感染、休克或者大手术后常见的并发症，其发病机制十分复杂，主要涉及炎症反应失衡、免疫功能紊乱、凝血功能障碍等多方面病理生理过程[2]。脓毒症病情凶险，死亡率高，一直是重症医学研究领域的热点。临床常用的脓毒症治疗方法主要有液体治疗与复苏，抗感染治疗和血流动力学支持[3]。中药治疗脓毒症具有较好疗效[4]，未来中药及其活性成分治疗可能成为脓毒症治疗的新方向。分析《太平圣惠方》治疗脓毒症的用药规律，发现治疗脓毒症药物使用频次位于前5位的是大黄、黄芩、甘草、栀子、麦冬等[5]。黄芩为唇形科（Labiatae）黄芩属（Scutellaria）多年生草本中药植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，味苦，性寒，归肺、胆、脾胃、大肠、小肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效。黄芩素（Baicalein），又名黄芩苷元、黄芩黄素，是从黄芩中提取的有效成分，其在生药中占5.41%，是黄芩的主要药效物质基础，具有抗病毒、抗菌、抗过敏、免疫调节等多种药理作用[6-7]。探讨黄芩素对脓毒症的治疗作用具有重要的研究意义，但目前相关黄芩素抗脓毒症的研究较少，因此，本研究构建脓毒症大鼠模型，观察黄芩素的治疗机制，以期为临床脓毒症治疗提供参考依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只SD大鼠（雌雄各半），体质量190 ～210 g，购自南京君科生物工程公司，动物质量合格证号：SCXK（苏）2016-0007。在山东大学动物实验中心按照实验动物管理条例进行饲养管理。饲养环境：温度（24 ± 1）℃，湿度45%～50%，大鼠活动饮水自由。大鼠适应性喂养1周。

1.2 药物、试剂与仪器黄芩，购自成都嘉叶生物科技有限公司；注射用乌司他丁，购自广东天普生化医药公司（批号：国药准字H19990133）。内毒素，购自上海泽叶生物科技公司；活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）及血浆纤维蛋白原（FIB）检测试剂盒，购自上海圻明生物科技有限公司；异硫氰酸荧光素标记CD3（FITCCD3+）、藻红蛋白标记CD4（PE-CD4+）、PE-Cy5-CD8+单克隆抗体，购自上海酶研生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1 抗体、Caspase-11抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗，购自上海嘉恒生物科技公司；白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒，购自上海恒斐生物科技公司；凝血分析仪，购自武汉科尔达医疗科技有限公司；Attune NxT流式细胞仪，购自北京昊诺斯科技公司。

1.3 黄芩素的提取[8]取黄芩20 kg 粉碎成粗粉，用乙醇回流提取3 次。减压回收乙醇至无乙醇蒸出，残余物加入85%乙醇，加热使大部分溶解，过滤，滤液用柱层析用硅胶，以柱层析法进行分离，用石油醚与氯仿按照体积分数1∶3 的比例洗脱。收取第2条黄色带，即得汉黄芩素（约100 g），经纯度检查，主要为黄芩素，含量大于90%。

1.4 分组与建模将40只大鼠随机分为正常组、模型组、黄芩素低剂量组、黄芩素高剂量组、乌司他丁组，每组8只。除正常组外，其余3组大鼠建立脓毒症模型[7]：根据大鼠体质量准备内毒素（10 mg/kg），加生理盐水溶解为10 mL，经大鼠尾部静脉注射（0.45 mL/kg）。建模后0.5 h，大鼠出现精神萎靡、活动减少、毛色杂乱无光泽、呼吸稍促、喜饮水和解稀便等脓毒症表现。将术后24 h作为时间观察截点，结果显示建模成功[9]。

1.5 干预方法黄芩素低、高剂量组大鼠分别给予黄芩素（生理盐水溶解）100、200 mg·kg-1·d-1腹腔注射，乌司他丁组大鼠给予注射用乌司他丁（生理盐水溶解）20万U/kg腹腔注射，正常组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水，每日1次，共干预3 d。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 凝血分析仪检测大鼠凝血指标 经大鼠尾部取血2 mL，应用凝血分析仪检测血浆APTT、PT及FIB 水平，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6.2 ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-6水平 经大鼠尾部取血2 mL，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6.3 流式细胞术检测大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分比和CD4+T细胞/CD8+T细胞（CD4+/CD8+）比值及辅助性T 淋巴细胞（Th）1/Th2 比值 取大鼠静脉血2 mL，根据试剂盒操作说明书充分标记，采用流式细胞仪检测T 淋巴细胞亚群，计数CD3+T、CD4+T、CD8+T 细胞的百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值。

1.6.4 苏木素-伊红（HE）染色法观察大鼠肺部病理损伤情况 建模成功后将大鼠用戊巴比妥麻醉处死，取肺组织，常规脱水后，浸蜡，石蜡包埋，制备4 μm 切片，脱蜡，水合，透明封片，染色。光镜下观察肺泡、肺间质水肿情况变化等。

1.6.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠肺组织Caspase-1、Caspase-11 蛋白表达水平 取大鼠肺组织，剪碎后加入裂解液，取上清液，通过蛋白定量分析，上样，电泳，转膜，膜封闭，Caspase-1、Caspase-11 一抗（稀释比例1∶1000）4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 二抗（稀释比例1∶4000）孵育2 h，显色等步骤，应用成像系统对电泳条带的光密度进行分析。

1.7 统计方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数± 标准差（±s）表示，多组间比较行单因素方差分析或重复测量方差分析，两组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆APTT、PT、FIB水平比较表1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血浆APTT、PT、FIB 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩素低、高剂量组和乌司他丁组血浆APTT、PT、FIB 水平均有所下降（P＜0.05）；黄芩素高剂量组与乌司他丁组各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠血浆APTT、PT、FIB水平比较Table 1 Comparison of plasma APTT，PT and FIB levels among various groups of rats （±s）

表1 各组大鼠血浆APTT、PT、FIB水平比较Table 1 Comparison of plasma APTT，PT and FIB levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与黄芩素低剂量组比较

组别正常组模型组黄芩素低剂量组黄芩素高剂量组乌司他丁组F值P值鼠数/只88888 APTT/s 14.25±2.9418.26±2.03①16.26±2.37①②15.02±1.56①②③15.65±2.18①②③3.621＜0.001 PT/s 11.21±0.7617.68±2.68①16.43±1.83①②15.31±1.16①②③15.36±1.94①②③14.560＜0.001 FIB/（g·L-1）2.12±1.613.59±2.65①2.46±1.66①②2.12±1.01①②③2.13±1.05①②③3.421＜0.05

2.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平比较表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩素低、高剂量组和乌司他丁组血清TNF-α、IL-6 水平均有所下降（P＜0.05）；而黄芩素高剂量组与乌司他丁组血清TNF-α、IL-6 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较Table 2 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels among various groups of rats （±s，pg·mL-1）

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6水平比较Table 2 Comparison of serum TNF-α and IL-6 levels among various groups of rats （±s，pg·mL-1）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与黄芩素低剂量组比较

组别正常组模型组黄芩素低剂量组黄芩素高剂量组乌司他丁组F值P值鼠数/只88888 TNF-α 20.26±1.2142.35±2.34①35.26±2.45①②24.23±1.52①②③25.35±1.68①②③181.800＜0.001 IL-621.02±1.0267.56±2.35①43.57±3.22①②38.26±2.11①②③39.44±1.13①②③492.700＜0.001

2.3 各组大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值比较表3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠外周血中CD3+T、CD4+T 淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值降低（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩素低、高剂量组和乌司他丁组外周血中CD3+T、CD4+T 淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2 比值均有所升高（P＜0.05）；黄芩素高剂量组与乌司他丁组各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠外周血CD8+T 淋巴细胞百分比比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值比较Table 3 Comparison of CD3+T，CD4+T，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+ratio and Th1/Th2 ratio in peripheral blood among various groups of rats （±s）

表3 各组大鼠外周血中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值比较Table 3 Comparison of CD3+T，CD4+T，CD8+T lymphocyte percentages and CD4+/CD8+ratio and Th1/Th2 ratio in peripheral blood among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与黄芩素低剂量组比较

组别正常组模型组黄芩素低剂量组黄芩素高剂量组乌司他丁组F值P值鼠数/只88888 CD3+T淋巴细胞/%42.21±6.4938.65±5.43①43.46±3.21①②44.12±2.54①②③45.26±4.52①②③11.050＜0.001 CD4+T淋巴细胞/%25.32±1.8920.26±1.03①46.26±1.01①②40.05±1.04①②③40.35±0.98①②③758.500＜0.001 CD8+T淋巴细胞/%22.32±4.2121.65±2.7622.32±2.2322.31±1.9823.21±2.240.3140.866 CD4+/CD8+比值1.34±0.291.31±0.13①2.01±0.23①②1.65±0.16①②③1.68±0.21①②③14.700＜0.001 Th1/Th2比值0.579±0.0450.315±0.059①0.545±0.068①②0.622±0.053①②③0.631±0.037①②③46.940＜0.001

2.4 各组大鼠肺组织病理表现比较图1结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肺组织肺泡腔缩小，肺间质水肿及肺实质变小，伴有大量炎性细胞浸润与出血；与模型组比较，黄芩素低剂量组肺组织病理损伤程度无明显差异，黄芩素高剂量组和乌司他丁组肺组织损伤范围较小，部分肺泡腔内仅仅出现少量出血与炎性细胞浸润，肺实变与肺间质水肿较轻。

图1 各组大鼠肺组织病理表现比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the histopathological manifestations of the lung tissue among various groups of rats（by HE staining，×200）

2.5 各组大鼠肺组织Caspase-1、Caspase-11蛋白表达水平比较表4、图2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肺组织中Caspase-1、Caspase-11蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩素低、高剂量组和乌司他丁组Caspase-1、Caspase-11 蛋白表达水平均有所降低（P＜0.05），黄芩素高剂量组与乌司他丁组各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠肺组织Caspase-1、Caspase-11的Western Blot电泳条带图Figure 2 Western Blot electrophoresis bands of Caspase-1 and Caspase-11 proteins in lung tissues in various groups of rats

表4 各组大鼠肺组织Caspase-1、Caspase-11蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of protein expression levels of Caspase-1 and Caspase-11 in lung tissues among various groups of rats

3 讨论

脓毒症患者体内存在炎性反应状态与免疫紊乱，两者可相互影响[10]。脓毒症是一种失控的、持久性炎症反应，是由感染因素诱发的全身性炎性反应综合征（SIRS）。临床中与脓毒症相关的研究众多，而感染及其所导致的机体变化是临床研究的重点[11]。IL-6 是公认的促炎因子，主要由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞和纤维母细胞合成分泌，是急性相反应的始发因子和主要物质，也是促进肝脏合成急相蛋白的主要细胞因子[12]。TNF-α是具有免疫调节作用的细胞因子，在脓毒症初期表达升高可以导致局部免疫炎症反应，并可随着疾病发展升高诱导器官损伤[13]。T淋巴细胞亚群在一定程度上能够反映机体的细胞免疫状态。CD3+T 为T 淋巴细胞总数，CD4+T 及CD8+T 为其亚型。CD4+T 为辅助/诱导T 淋巴细胞（Th），且有辅助淋巴细胞产生抗体，诱导T淋巴细胞转变为效应细胞等功能，CD8+T 为抑制/杀伤T 淋巴细胞（Ts），具有介导对病原体感染的自身细胞杀伤和溶解作用，此两种细胞均为特异性细胞免疫的主要效应细胞[14]。在正常情况下，CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴细胞和CD4+T/CD8+T值在正常范围，CD4+T、CD8+T 淋巴细胞通常处于动态平衡及相互反馈调节状态。CD3+T、CD4+T、CD8+T 淋巴细胞和CD4+/CD8+比值的改变代表机体免疫功能的改变[15]。脓毒症患者可以出现免疫失衡，表现为CD3+T、CD4+T 淋巴细胞和CD4+/CD8+比值的下降，且其与疾病严重程度存在一定相关性。CD3+T、CD4+T 淋巴细胞和CD4+/CD8+比值可以作为脓毒症治疗过程中疾病严重程度的检测指标[15]。Th1/Th2的平衡对维持正常免疫应答起重要的作用。正常情况下，Th1/Th2处于相对平衡的状态。探讨脓毒症患者Th1/Th2细胞失衡与疾病严重程度、肺损伤的关系显示，Th1/Th2值的降低预示着疾病严重程度的加大，预后不良，同时脓毒症合并肺损伤患者促炎Th1 细胞增高，Th1/Th2 平衡向Th1 方向漂移[16]。

本研究结果显示，经黄芩素干预后，脓毒症大鼠血清升高的TNF-α、IL-6 水平均有所下降，降低的外周血CD3+T、CD4+T 淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值及Th1/Th2比值有所升高，黄芩素高剂量组各指标与乌司他丁组比较，差异不明显。表明黄芩素可下调脓毒症大鼠的炎性因子水平、改善免疫紊乱。

作为脓毒症的核心机制，过于强烈的免疫反应常常伴随大量炎症细胞因子的释放，包括IL-6、TNF-α 等。对Caspase-11 介导的非经典炎性体通路在脓毒症中介导着多种炎症介质的释放。细胞焦亡在脓毒症过于强烈的免疫反应中发挥了重要的作用，被病原体入侵的细胞通过细胞焦亡释放出大量促炎信号和病原体，并引发级联反应，关于细胞焦亡的研究揭示了Caspase 家族在其中所扮演的重要角色。细胞焦亡存在2种途径，分别为依赖Caspase-11的非经典途径和依赖Caspase-1 的经典途径。其中，Caspase-11与细胞焦亡关系最为密切。Caspase-11被认为可调节细胞焦亡的发生，敲除Caspase-11 可以明显改善脓毒症小鼠的生存率[17]。脓毒症可引起小鼠海马神经元损伤及Caspase-1 介导的焦亡的激活，抑制Caspase-1 介导的焦亡具有神经元保护和认知保护作用[18]。

本研究结果显示，模型组大鼠肺组织Caspase-11、Caspase-1 蛋白表达水平较正常组下降，干预后，黄芩素低、高剂量组和乌司他丁组Caspase-11、Caspase-1 蛋白表达水平较模型组升高，黄芩素高剂量组各指标与乌司他丁组比较，差异无统计学意义。表明黄芩素可能通过抑制脓毒症大鼠肺组织Caspase-11、Caspase-1 蛋白表达，抑制细胞焦亡，进而减轻炎症反应，从而减轻脓毒症器官损害。

凝血系统与炎症反应共同参与脓毒症的发生发展。脓毒症患者多数具有凝血功能障碍，脓毒症凝血功能障碍是一个动态连续的病理过程，其发病机制是由促凝机制上调、天然抗凝机制下调及纤溶系统受抑制共同驱动的，导致微循环障碍，以至发生多脏器功能的障碍[19]。脓毒症严重时还会发生血栓形成和弥漫性出血的暴发性弥散性血管内凝血（DIC）。APTT、PT、FIB是能够反映凝血功能的指标，APTT 主要反映机体内源性凝血程度，PT 是反映凝血因子水平的外源性指标，并随着脓毒症疾病程度的升高而升高[20]。FIB 为干细胞合成及分泌的纤维蛋白，其表达水平升高可增加血栓发生的风险[21]。本研究发现，经过黄芩素干预后，脓毒症组大鼠APTT、PT、FIB 的水平均有所降低，其中，黄芩素高剂量组降低作用明显，与乌司他丁组比较，差异无统计学意义，表明黄芩素能有效改善脓毒症大鼠的凝血紊乱情况，阻断凝血-炎症间相互促发的恶性循环。

综上所述，黄芩素可改善脓毒症大鼠靶器官肺损伤，其机制可能与抑制肺组织Caspase-1、Caspase-11蛋白表达，抑制细胞焦亡，进而减轻炎症反应，并调节免疫应答及凝血功能有关。