基于Bcl-2/Bax凋亡探讨仙子益真胶囊对大鼠卵巢储备功能减退的作用机制

温丹婷， 彭潇， 郑玮琳， 徐珉

（1.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510045；2.广东省中医院，广东广州 510120；3.广东省第二人民医院，广东广州 510310）

卵巢功能过早衰竭是目前严重影响女性生殖健康的临床常见疑难病，如何治疗和延缓卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve，DOR）仍然是目前妇科临床处理过程中最具挑战性的问题。中医药在提高DOR 治疗有效率及稳定病情方面有一定优势。中药复方仙子益真胶囊是根据多年的临床观察数据与基础研究成果，结合中医经典理论与全国名老中医李丽芸教授“调经重在补肾”的学术思想，提炼、创制而来的，具有滋养肝肾、填精益髓功效，前期临床疗效研究已肯定仙子益真胶囊治疗DOR 的有效性、安全性和稳定性。本课题组前期研究证实，仙子益真胶囊可以提高卵巢早衰模型小鼠血清雌二醇（E2）含量，降低卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）含量，改善卵巢早衰小鼠生殖内分泌环境[1-2]，亦可有效改善雷公藤多苷诱导DOR 大鼠卵巢功能，提高卵巢储备功能[3]。但仙子益真胶囊的治疗机制仍未完全阐明，限制了其推广运用。本研究以Bcl-2/Bax凋亡途径为着眼点，探讨仙子益真胶囊治疗DOR的作用机制，旨在明确其关键作用靶点，以期为应用仙子益真胶囊临床早期预防和解决DOR 提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物60只12周龄SPF 级雌性SD 大鼠，体质量250 ～270 g，由南方医科大学实验动物中心提供[SCXK（粤）2016-0041]，动物质量合格证编号：44002100014319。饲养于室温22～26 ℃、明暗各12 h 的SPF 级动物实验室内，适应性喂养1 周后备用。实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2018-0094。

1.2 实验药品仙子益真胶囊（由熟地黄、菟丝子等组成，每粒约含生药量1.65 g），由广东省中医院提供，粤药制字：Z20070627，生产批号：189101；雷公藤多苷片，远大医药黄石飞云制药有限公司生产，批号：20170901；戊酸雌二醇片，拜耳医药保健有限公司生产，批号：2011361A；地屈孕酮片，荷兰Abbott Biologicals B.V 公司生产，批号：1091278。

1.3 主要试剂与仪器核转录因子kappaB（NF-κB）p65抗体（美国Cell Signaling公司）；雌激素受体α（ERα）抗体、孕激素受体（PR）抗体（美国Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（美国Thermo 公司）；蛋白酶抑制剂（瑞士Roche公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（碧云天生物有限公司）；柠檬酸组织抗原修复液[迈新公司（中国）]；逆转录酶试剂盒（美国Promega 公司）；TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司）；即用型高效免疫组化二抗试剂盒[优宁维公司（中国）]。酶标仪（型号：EONC）、PCR 扩增仪（型号：CFX96）（美国Bio-Rad 公司）；凝胶成像分析仪（上海培清公司，型号：JS-680B）；漩涡混合器（上海精科实业有限公司，型号：XW-80A）；台式高速冷冻离心机（湖南湘仪公司，型号：TGL-16）；化学发光成像系统（美国Bio-Rad 公司）；转移电泳槽（广州誉维生物科技仪器有限公司，型号：VE-186）；垂直电泳槽（广州誉维生物科技仪器有限公司，型号：VE-180B）。

1.4 DOR 大鼠模型构建SPF级健康雌性大鼠适应性喂养，每日进行阴道涂片检查，随机抽取性周期正常的大鼠10只作为正常组，其余的为造模诱导组。正常组给予等体积生理盐水灌胃。造模诱导组参照文献研究[4]给予雷公藤多苷片50 mg·kg-1灌胃，每日2次，连续28 d。模型建立开始，每天通过观察大鼠阴道脱落细胞涂片了解大鼠动情周期变化。如果出现动情期延长或动情周期延长，可判断动情周期紊乱；如出现持续10 d 及以上的动情间期，则判断动情周期失常；当出现动情周期失常，阴道角化上皮细胞减少，有核上皮细胞混杂，表示建立模型成功[5]。将造模组大鼠按随机数字表分为模型组，中药低、中、高剂量组，西药组，每组10只。

1.5 分组与给药造模第14天开始给药。给药剂量按成人体质量（kg）的临床用药剂量以人鼠比例换算[6]，药物均溶于生理盐水制成等体积混悬液灌胃。正常组给予生理盐水10 mL/kg 灌胃，中药低、中、高剂量组给予仙子益真胶囊混悬液0.625、1.25、2.5 g·kg-1·d-1灌胃，西药组给予补佳乐、地屈孕酮灌胃（具体方法：第1天开始，戊酸雌二醇0.14 mg·kg-1·d-1，连续4 d；第5天，地屈孕酮片0.92 mg·kg-1·d-1，1 d。第6天，停药1 d 后，如此继续序贯用药）。干预28 d后，选择动情间期取材。正常组给予等体积生理盐水灌胃。

1.6 指标检测与方法

1.6.1 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测大鼠卵巢内凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 mRNA表达水平 应用TRIzol试剂提取卵巢组织的总RNA。Bcl-2、Bax、Caspase-3 和p53 以及β-actin mRNA 引物的合成均由华大基因公司完成。RT-PCR 引物序列见表1。取RNA 样品，用核酸分析仪进行定量。以5 μL RNA 作为模板逆转录合成cDNA，按照SYBR Green PCR Reagents 说明书应用7500 Real Time PCR System 进行扩增。反应条件如下：95 ℃预变性3 min，1 个循环；95 ℃变性10 s，60 ℃30 s 退火及延伸，共持续40 个循环。每个循环在60 ℃延伸时收集荧光值，测定达到荧光阈值时的最小循环次数（Ct 值），完成后进行溶解曲线测定。以β-actin 为内参基因，2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ctβ-actin）处理组-（Ct目的基因-Ctβ-actin）对照组。溶解曲线程序设置为：95 ℃10 s；65 ～95 ℃，每0.5 ℃进行1次溶解曲线分析。记录数据并分析实验结果。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.6.2 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测卵巢组织中NF-κB p65 蛋白及子宫内膜ERα、PR 蛋白表达水平 液氮脆化卵巢组织、子宫内膜组织后研磨，用加入蛋白酶抑制剂的RIPA 强裂解液在冰上裂解30 min，振荡，离心，转移上清至新EP管。用BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。用5×Loading Buffer 混合样品，100 ℃10 min 变性，离心，-80 ℃保存。取30 μg 相应蛋白样品上样，100 V恒压跑电泳，300 mA 90 min 转膜，50 g/L奶粉封闭，一抗（NF-κB p651∶100稀释，ERα 1∶200稀释，PR 1∶200 稀释），4 ℃冰箱孵育过夜后，TBST 洗膜10 min × 3 次。第2天，二抗（1∶5000稀释）室温孵育1 h后，TBST洗膜10 min×3次。于化学发光成像系统免疫发光，用Image Lab 显影成像。实验至少重复3次，应用IamgeJ软件分析条带灰度值。

1.7 统计方法采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。符合正态分布与方差齐性的两组间计量资料比较采用两独立样本t检验。多组间计量资料比较符合条件，采用单因素设计方差分析，组间两两比较采用LSD 法；多组间计量资料比较不符合应用条件，采用Welch’s ANOVA，组间两两比较采用Games-Howell 法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠卵巢组织凋亡因子Bax、Caspase-3、p53、Bcl-2 mRNA表达比较图1、图2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织Bax、Caspase-3、p53 mRNA 表达水平明显升高，Bcl-2 mRNA表达水平明显降低，Bcl-2/Bax比率下降（均P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组大鼠卵巢组织Bax、Caspase-3、p53 mRNA 表达水平呈剂量依赖性降低，Bcl-2 mRNA 表达水平呈剂量依赖性升高（均P＜0.05），Bcl-2/Bax 比率升高。以上结果表明，雷公藤多苷诱导的DOR 大鼠存在卵巢细胞凋亡，仙子益真胶囊可减少DOR 大鼠卵巢细胞凋亡。

图1 各组大鼠卵巢组织中Bax（A）、Caspase-3（B）、p53（C）mRNA相对表达量比较Figure 1 Comparison of relative mRNA expression levels of Bax（A），Caspase-3（B）and p53（C）in ovarian tissues among various groups of rats

图2 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2 mRNA相对表达量（A）及Bcl-2/Bax比率（B）比较Figure 2 Comparison of relative mRNA expression level of Bcl-2（A）in ovarian tissues and Bcl-2/Bax ratio（B）among various groups of rats

2.2 各组大鼠卵巢组织NF-κB p65蛋白表达比较图3结果显示：与正常组比较，模型组大鼠卵巢组织NF-κB p65 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组和西药组大鼠卵巢组织NF-κB p65 蛋白表达水平升高，其中，中药中、高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 各组大鼠卵巢组织NF-κB p65蛋白表达比较Figure 3 Comparison of NF-κB p65 protein expression in ovarian tissues among various groups of rats

2.3 各组大鼠子宫内膜组织ERα、PR 蛋白表达比较图4结果显示：与正常组比较，模型组大鼠子宫内膜组织ERα、PR蛋白表达水平明显下降（均P＜0.05）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组及西药组大鼠子宫内膜组织ERα、PR 蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05），且中药各组呈剂量依赖性。

图4 各组大鼠子宫内膜组织中ERα（A）、PR（B）蛋白表达量及ERα、PR蛋白电泳图（C）Figrure 4 Expression of protein expression levels of and electrophoretogram of ERα and PR in endometrial tissues in various groups of rats

3 讨论

中医学“肾-天癸-冲任-胞宫”之性生殖链与现代医学“下丘脑-垂体-卵巢轴”极为相似。现代医学认为，下丘脑、垂体、卵巢释放的激素调节女性性周期，“天癸”可能相当于垂体、卵巢、睾丸等性腺的内分泌素。“肾”主宰女性生殖机能的发育、旺盛与衰退，“肾”对女性卵巢生理功能的实现起着决定性作用。临床报道及药理研究表明，雷公藤多苷可损伤女性卵巢功能且损伤有可逆性，“以方测证”证实该模型为肾精气亏虚卵巢功能低下模型[7]。以雷公藤多苷50 mg/kg 剂量造模，其稳定性和可逆性均较好[7]。因此，本研究确定雷公藤多苷片50 mg/kg灌胃大鼠28 d构建卵巢功能减退（DOR）药效学研究动物模型，并基于大鼠阴道上皮细胞会随卵巢激素的周期性变化而变化的特点，通过阴道涂片法检测大鼠动情周期，直观判断其性腺功能是否正常[8]。本课题组前期研究表明，仙子益真胶囊能够有效改善雷公藤多苷导致的大鼠卵巢功能低下的状况，提高卵巢储备功能[3]。故本研究选择雷公藤多苷构建DOR实验动物模型，高度模拟了女性卵巢储备功能减退的状态，结合中医基础理论，进一步从细胞分子基因水平探讨了仙子益真胶囊对DOR 的治疗作用，以Bcl-2/Bax凋亡途径为着眼点，阐明其治疗DOR的可能机制和作用靶点，可为院内制剂的新药开发提供基础数据。

3.1 仙子益真胶囊对DOR大鼠卵巢Bcl-2/Bax及相关因子的影响细胞凋亡是卵巢功能下降的病理特征之一。凋亡过程受多基因调控，研究表明，凋亡信号传导途径有细胞表面死亡受体通路、线粒体通路以及内质网通路，其中，Caspase-3是最重要的细胞凋亡效应蛋白，能够参与多种途径诱导细胞凋亡，是凋亡的主要执行者[9]。而p53基因作为转录因子，广泛存在于卵巢组织，监控和调节细胞的生存或凋亡，影响卵子的发育与成熟。p53基因被敲除后，颗粒细胞的凋亡率明显降低，卵泡闭锁的数目也显著降低[10]。

Bcl-2 是在B 细胞滤泡性淋巴瘤染色体断裂点发现的凋亡抑制基因。而Bax 则是Bcl-2 家族中研究最为广泛的促凋亡基因，在凋亡过程中起枢纽作用。Bcl-2 和Bax 蛋白相互作用可形成异源二聚体，抑制凋亡；而若是Bax蛋白之间相互作用则可形成同源二聚体，从而促进凋亡[11]。Bcl-2/Bax 比率决定细胞凋亡发生与否，有“死亡开关”之称。若细胞呈Bax 过表达，可使细胞内Caspase 激活效应增强[12]，并可拮抗Bcl-2 对细胞的保护作用，进而引起细胞的凋亡。

研究发现，Bcl-2/Bax 表达对卵泡的生长发育有调控作用。卵泡在生长发育过程中的大量丢失与Bax 的持续表达相关，而当卵泡需要进一步增殖时，Bcl-2 选择性表达，可与Bax 互相调节，Bc1-2＞Bax 则细胞趋于存活，Bax＞Bc1-2 则细胞趋于凋亡，使卵巢储备维持在合理水平。然而，当Bcl-2 与Bax 表达失调时，在发育过程中的卵泡开始凋亡，形成闭锁卵泡，最终导致DOR[13]。

NF-κB 作为炎症启动和调节过程的关键转录因子[14]，在炎症反应中起重要作用。NF-κB 介导的炎症信号通路是调控炎症反应的经典信号通路，参与多囊卵巢综合征（PCOS）患者血管内皮损伤[15]。NF-κB对细胞凋亡存在双向调节作用，既可以促进凋亡也可以抑制凋亡。NF-κB 过度活化，一方面可激活Caspase-3、Bcl-2 使两者的表达增加，诱导细胞凋亡；一方面可以激活同处一个信号传导系统中位于其下游基因的Bcl-2，过度表达的Bcl-2发挥其自身的抑凋亡作用，或与NF-κB在细胞质内形成Bcl-2-NF-κB 复合物，发挥抑凋亡的作用[16-17]。

本研究结果表明，仙子益真胶囊可通过上调Bcl-2、下调Bax 及相关凋亡因子的表达来减少DOR 大鼠卵巢颗粒细胞凋亡，从而改善卵巢储备功能，保护卵巢。亦提示NF-κB p65活化使Bcl-2过表达或者形成复合物而发挥其抑凋亡作用可能是仙子益真胶囊治疗DOR 的作用机制之一，此为中药复方多靶点多通路作用的起效模式的论证提供了科学依据。

3.2 仙子益真胶囊对DOR大鼠子宫内膜ERα、PR蛋白表达的影响雌激素（E2）、孕激素（P）以及雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）是形成良好内膜容受性的重要因素，其中任一因素表达失常将导致着床失败[18]。本研究结果显示：雷公藤多苷诱导的DOR模型大鼠子宫内膜PR、ERα蛋白表达明显下降；中药低、中、高剂量组大鼠子宫内膜PR、ERα 蛋白表达较模型组呈剂量依赖升高。表明仙子益真胶囊可改善DOR 大鼠卵巢储备功能，还可改善子宫内膜容受性。

综上所述，仙子益真胶囊可抑制卵巢颗粒细胞凋亡，改善卵巢储备功能，保护卵巢，还可改善子宫内膜容受性，从而有利于胚泡的植入，以提高DOR 患者胚胎着床率。本研究结果可有助于进一步完善生殖生理体系内容，丰富“肾主生殖”理论，亦显示仙子益真胶囊治疗DOR 具有良好的应用前景。