瓜蒌薤白汤对脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用

孙 敏, 刘玉龙, 刘 科, 刘玲玲, 张鲁宁, 颜贵明, 卞 海

(安徽中医药大学 中西医结合学院，安徽 合肥 230012)

缺血性脑卒中是最多见的脑血管疾病,占全部脑中风的69.6%～70.8%[1]。脑卒中后,及时恢复血氧供应是临床治疗的首要原则,但这极大可能会引发二次伤害[2]。除神经受损外,缺血后再灌注可加剧脑损伤[3]。已有数据表明氧化应激是脑缺血再灌注损伤的强有力介质[4]。

《金匮要略》中对瓜蒌薤白汤有所记载,表明其由瓜蒌、薤白和白酒构成,常用于治疗冠心病和心梗等病症。李明明[5]研究说明瓜蒌薤白汤能明显提升心肌缺血再灌注损伤大鼠模型的血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、减少丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。瓜蒌薤白汤中瓜蒌子醇提物可通过清除DPPH自由基和ABTS自由基来发挥抗氧化作用[6]。薤白的汁液对大鼠血清和T淋巴细胞中的SOD和CAT有明显的保护作用,可抑制血清脂质过氧化物的形成[7]。本研究建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,以瓜蒌薤白汤为干预手段,研究此方对于脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)大鼠的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药物及主要试剂

瓜蒌薤白汤:取48 g瓜蒌、24 g薤白,用白酒浓缩回流提取,使药物浓缩至含生药1 g/mL。瓜蒌和薤白(安徽中医药大学第一附属医院)；阳性药物为尼莫地平片(20 mg/片,批号:2006090);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,北京索莱宝科技有限公司,批号:520C031)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20210617)；丙二醛(MDA)测试盒(南京建成生物工程研究所,批号:20210616)。

1.2 实验仪器

水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司);OLYMPUSBX51正置显微镜(上海富莱光学科技有限公司);K3酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.3 试验动物

40只SPF级SD雄性大鼠(240±20) g,饲养于安徽中医药大学中西医结合学院动物实验中心,动物许可证号:SCXK(苏)2017-0003。所有动物均经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准,动物伦理编号:AHUCM-rats-2021047。

1.4 制备CIRI模型

实验分为4组:假手术组、模型组、瓜蒌薤白汤组和尼莫地平组,每组10只大鼠。采用改良线栓法制作大鼠局灶性CIRI模型[8]:腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉大鼠,右侧颈部脱毛,在颈部脱毛部位擦拭碘伏剪去表皮,分离组织,找出颈总动脉。先分离右侧颈总动脉,再分离颈外动脉和颈内动脉,小心剥离迷走神经,避免其损伤。从颈总动脉向上剥离,结扎颈总动脉下端和颈外动脉,用动脉夹夹住颈内动脉,用眼科剪在颈总动脉处切开一个小口,插入深度约为1.8～2.2 cm的0.285 mm线栓,然后缝合肌肉组织。缺血2 h后取出部分线栓,再灌注24 h观察模型。假手术组仅进行钝性分离缝合,不做任何其他处理。

1.5 神经功能损伤评分标准

灌注24 h后,根据Longa等[9]的5点评分系统,由不了解研究方案的研究者对神经功能缺损进行评分。评分系统如下:(1)正常行走或无神经功能缺损:0分。(2)不能完全伸展对侧前爪或轻度局灶性神经功能缺损:1分。(3)向对侧盘旋或中度局灶性神经功能缺损:2分。(4)向对侧坠落或严重的局灶性神经功能缺损：3分。(5)意识水平为4级的抑郁症患者不能自发行走：5分。

1.6 给药方法

灌胃给药,瓜蒌薤白汤2.16 g/(kg·d),阳性药[4]尼莫地平0.01 g/(kg·d),假手术组与模型组持续3 d灌胃给予等量生理盐水。

1.7 取材

3 d后取材,使大鼠处于麻醉状态下,首先腹主动脉取血,随后快速取出脑组织,每组大鼠取多个脑组织作冠状切片,随后用4%多聚甲醛中固定不动,48 h后脱水包埋。此外,每组再取5只置于-20 ℃冷冻20～30 min后用于TTC染色,剩余组织置于-80 ℃下保存备用。

1.8 检测指标及方法

1.8.1 TTC染色测脑梗死体积 取出脑组织,制作薄厚约2 mm的冠状切片,将切片后的脑片放入六孔板中,添加2%TTC染液,37 ℃恒温孵育,孵育全过程中适度转动冠状切片,20 min后取出。将TTC染色的切片置于组织固定液中,24 h后取出拍照,用Image-Pro Plus 6.0测算各切片脑梗死体积以及占大脑半球体积的百分数。

1.8.2 HE染色观察脑组织病理形态 取组织脱水，包埋在石蜡中,并切成5 μm的组织切片。通过脱蜡、脱水处理后,切片用苏木精和伊红染色,随后用中性树胶封片,放置在高倍显微镜下(×400)观察病理形态。

1.8.3 SOD、MDA的测定 腹主动脉取血后,将大鼠血清在常温下放置30 min,以3 500 r/min离心15 min,取上层血清。根据SOD、MDA试剂盒说明书分别测定大鼠血清中SOD、MDA的含量。

1.9 数据分析

2 结果

2.1 神经功能损伤评分

通过几名与本实验无关人员对成模后的大鼠神经功能评分,结果如表1所示,造模成功后除假手术组外,其余各组无显著性差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分情况

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较

结果表明,假手术组动物处于正常状态,脑组织无缺血现象。模型组脑梗死体积明显高于假手术组,具有统计学意义(P<0.05);瓜蒌薤白汤组和尼莫地平组与模型组相比具有统计学意义(P<0.05);瓜蒌薤白汤组与尼莫地平组无显著性差异(P>0.05)。结果如图1和表2所示。

图1 各组大鼠脑组织TTC染色结果

表2 各组大鼠脑梗死体积百分比

2.3 各组大鼠脑组织病理变化

模型组脑组织受损,间质水肿,核质分离,排列散乱,间隙较大(见图2中黑色箭头处);与模型组相比,瓜蒌薤白汤组和尼莫地平组脑损伤程度明显改善,细胞排列更规则有序,细胞间隙更小;假手术组脑组织未见损伤,神经细胞排列有序,包膜完整,细胞间隙正常(图2)。

图2 各组大鼠脑组织HE染色(×400),比例尺=25 μm

2.4 大鼠血清中SOD、MDA含量

机体清除氧自由基的能力用SOD来表示,自由基对细胞攻击的严重程度用MDA来表示。如表3所示,与假手术组相比,模型组SOD活力显著降低,MDA含量显著升高(P<0.05);瓜蒌薤白汤治疗后SOD活力显著升高,MDA含量显著降低(P<0.05);瓜蒌薤白汤组与尼莫地平组无显著性差异(P>0.05)。

表3 各组大鼠血清中SOD、MDA的含量变化

3 结论与讨论

中药是临床应用的主要形式,是由多种单味中药按内在质量比组合而成,以达到疗效和减少副作用的目的,已被千百年来广泛的临床实践所证明。薤白与瓜蒌、半夏、枳壳、银杏等合用,形成瓜蒌薤白汤、瓜蒌薤白半夏汤、枳实薤白桂枝汤治疗胸梗阻心绞痛[10]。迄今,在这3个方剂的基础上,加上中药,发展出了众多的加味方剂。瓜蒌薤白汤主治胸痹,近年来,也用于脑缺血再灌注损伤的治疗[11]。瓜蒌薤白汤为理气剂,具有通阳散结,行气祛痰的功效。瓜蒌桂枝汤已应用于中风后肢体痉挛的治疗,疗效良好,副作用少[12]。Chen等[13]在临床试验中发现,瓜蒌桂枝汤可通过改善肢体肌肉张力和运动功能来促进脑卒中后的恢复,从而提高脑卒中患者的生活质量。目前,关于瓜蒌薤白汤抗CIRI的具体机制研究较少。本研究从氧化应激的角度对其具体机制进行初步探讨。

CIRI大鼠存在神经功能缺损和运动障碍,因此脑组织的血液供应对机体具有特殊意义。TTC染色和HE染色显示研究模型成功建立。除假手术组外,其余各组大鼠皆在造模后显现出不同程度的神经功能受损和病理学损伤。结果表明,瓜蒌薤白汤可以改善脑缺血再灌注模型大鼠的脑组织病理学损伤。

脑缺血后血氧供应恢复引起的再灌注损伤涉及氧化应激、炎症反应和程序性细胞死亡等多种病理机制[14]。脑缺血时ROS过度产生,再灌注后缺氧部分引入新的氧分子,使得ROS再度增长,导致缺血脑组织抗氧化能力超负荷,最终导致氧化应激损伤、神经功能障碍乃至细胞死亡[2]。MDA作为ROS的主要产物,可以在一定程度上反映ROS造成的损伤,进而表现出氧自由基的含量。SOD是体内天然存在的超氧自由基清除因子,一般来说,脑血管内皮细胞产生超氧化物歧化酶。作为唯一能特异性清除O2的抗氧化酶,SOD能发生歧化反应,阻断过氧化引起的毒性作用[15]。ROS通过消耗SOD阻止机体抗凋亡信号通路的激活,导致脑损伤。因此,抑制缺血再灌注后细胞内MDA的含量,促进SOD的活力是抵抗CIRI的途径之一。本研究结果显示,瓜蒌薤白汤可以显著降低脑缺血再灌注损伤大鼠血清中MDA的含量,显著升高SOD的活力,表明瓜蒌薤白汤可能是通过抗氧化应激发挥的脑保护作用。

研究结果表明,瓜蒌薤白汤可改善神经功能受损,使脑梗塞体积减少,降低脑组织的病理损伤,可通过上调SOD和下调MDA含量来治疗CIRI。本研究从氧化应激角度对瓜蒌薤白汤抗CIRI的机制进行了初步探索,对于抗氧化应激的相关通路机制尚需进一步探究。