安徽省兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及PCR诊断方法的建立

谢长文, 范红结, 刘德义

(1. 宿州职业技术学院, 安徽 宿州 234101; 2. 南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 210095; 3.安徽科技学院 动物科学学院, 安徽 凤阳 233100)

支气管败血波氏杆菌(Bordetellabornchispetica, Bb)又叫支气管鲍特杆菌或博德特氏杆菌，简称波氏杆菌，该菌主要引起兔(包括野兔、饲养兔和实验兔)的一种传播广泛、侵害呼吸系统的、多发的急慢性传染病，感染动物主要以鼻炎、支气管炎、支气管肺炎和脓疱性肺炎为特征[1-2]。圈舍环境卫生差、湿度大、养殖密度大、空气污浊等原因极易造成家兔感染本病并迅速在兔场内传播[3-4]。近年来国内外对兔肉食品、兔毛皮制品的需求量急增，我国家兔养殖结构已由以往的散养模式向规模化养殖模式快速发展，但安徽北部地区许多养兔场在扩大养殖规模的同时，忽略了饲养管理水平、养殖技术和疫病防控技术的提高，导致兔场兔波氏杆菌病多发，且该病应用常规的细菌学、血清学等手段检测时存在耗时、耗力、灵敏度较低等缺点，导致本病在很多养兔场长期隐性存在难以根除，现急需一种简捷、快速、特异性高、低成本的检测本菌的方法。本试验从皖北地区多个疑似发生本病的大型养兔场采取病料，对兔波氏杆菌进行分离鉴定，并建立了针对该菌的PCR快速诊断方法，为皖北地区养兔场准确的掌握本病在兔群中的流行状况，提早做好防疫提供依据，进而降低皖北地区养兔场本病的感染率和死亡率。

1 材料与方法

1.1 供试材料

主要仪器设备：台式高速离心机(eppendorf公司)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；冰柜(青岛澳柯玛股份有限公司)；PCR扩增仪(TaKaRa公司)；全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)；电泳仪(BIO-RAD公司)；自动颗粒制冰机(太仓市华美生化仪器厂)。

病料来源:安徽北部地区4家疑似发生兔支气管败血波氏杆菌病的大型兔场，解剖无菌采集发病兔只肺脏置-20 ℃保存。

主要试剂:马丁肉汤；麦康凯琼脂培养板；5%的绵羊血改良B-G培养板；Bb诊断血清，标准兔支气管败血波氏杆菌，兔巴氏杆菌，兔魏氏梭菌，金黄色葡萄球菌和兔大肠杆菌等(江苏省农业科学院兽医研究所兔病研究室提供)；细菌微量生化鉴定管，染色试剂盒，药敏纸片等(杭州天和微生物试剂有限公司)；柱式细菌DNAout提取试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)；pMD19-T载体，DNA胶回收试剂盒，DH5α感受态细胞，PCR扩增所需试剂(宝生物工程(大连)有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的分离培养与纯化 取采集的病变肺脏，分别划线接种于麦康凯琼脂培养板，37 ℃恒温箱中培养24～48 h，观察菌落的生长状况，挑取孤立单一的疑似菌落，继续划线接种于5%绵羊血改良的B-G培养板进行纯化培养。

1.2.2 细菌的形态学与血清学鉴定 挑取少量菌落涂片，进行革兰氏法染色，显微镜下观察细菌形态和着色情况；挑取分离菌落接种于马丁肉汤中，37 ℃恒温箱中培养24 h，吸取等量的菌液和标准的Bb血清混于玻片上，2 min后观察有无凝集反应。

1.2.3 生化鉴定与药物敏感性试验 分别取100 μL菌液接种于不同的微量生化鉴定管中，37 ℃恒温箱中培养48～72 h后观察结果；将分离株菌液均匀涂布于含有绵阳血的琼脂培养皿上，表面贴上药物敏感纸片，37 ℃恒温箱中培养24 h后观察结果。

1.2.4 PCR鉴定与BLAST比对 提取分离菌株基因组，根据文献报道选用16S rRNA基因测序技术设计一对引物[5](DNT-F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3',DNT-R:5'-GCAGGGGAAGGCACCATT-3')，反应总体积设为25 μL，逐一加入Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 1.0 μL，上下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，Bb基因组DNA模板1.0 μL，10×Taq Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.0 μL。在94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸110 s，30个循环，72 ℃延伸10 min作为反应条件进行PCR扩增，预期获得片段大小约为1 492 bp；扩增产物进行电泳、凝胶成像、回收、纯化，回收纯化的产物利用pMD19-T试剂盒进行连接，转化DH5α感受态细胞后送上海Invitrogen公司测序，最后对所得序列进行BLAST比对。

1.2.5 DNA模板的制备 无菌条件分别培养本研究分离的Bb菌、标准Bb菌、兔巴氏杆菌、兔魏氏梭菌、金黄色葡萄球菌和兔大肠杆菌，依据柱式细菌DNAout提取试剂盒操作说明制备DNA模板，放4 ℃冰箱备用或放-20 ℃冰箱长期保存。

1.2.6 PCR引物设计与合成 利用GenBank报道的波氏杆菌丝状血凝素基因(AF111796)设计1对引物(上游引物：5'-GCGAGCAGACGAGCCAAAG-3'；下游引物：5'-TGCGGAGCCATCCCAAC-3')，预计目的片段约734 bp。PCR反应总体积设定为25 μL，对本研究所得的Bb菌株进行扩增，回收、纯化扩增产物后连接pMD19-T载体，连接产物转化DH5α感受态细胞，将转化后的菌液涂布于预热的LB平板(含100 μg/mL Amp)，37 ℃培养12 h获得阳性菌落，挑单个菌落置入LB的培养液中，200 r/min，37 ℃摇床培养12 h制备重组质粒的DH5α菌液，之后用煮沸法提取细菌的重组质粒模板置4 ℃保存，设PCR反应总体积为25 μL，以T载体鉴定通用引物(上游引物：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；下游引物：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')，对提取的重组质粒进行验证，阳性产物送上海Invitrogen公司测序。

1.2.7 PCR条件优化 反应总体积设定为25 μL，依次改变反应体系中的Mg2+浓度、不同退火温度(55、56、57、58、59、60 ℃)和不同循环数(25循环、30循环、35循环)，分别进行PCR扩增，确定最佳PCR反应条件。

1.2.8 PCR特异性检测和敏感性试验 以25 μL为反应总体积，以94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸110 s，30个循环数，72 ℃延伸10 min为PCR反应条件，对兔波氏杆菌、兔巴氏杆菌、兔魏氏梭菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌DNA模板同时进行PCR扩增、电泳、观察结果和拍照；取分离株培养液，菌液浓度为7.2×1010CFU/mL，采取9个梯度10倍稀释后粗提不同浓度菌液的DNA模板，以25 μL作为反应总体积，分别取不同浓度的DNA模板1 μL进行PCR扩增。

1.2.9 对比试验 用鼻拭子从宿州某肉兔场无菌采集50份不同症状的鼻腔分泌物进行细菌培养，用常规的直接凝集法检测，同时运用建立的PCR检测，并对检测结果进行对比。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的形态观察与血清学检测

对分离菌株进行涂片，革兰氏染色后镜检显示该菌为两端钝圆、两极着色不明显的革兰氏阴性的短杆菌(图1)，在麦康凯琼脂培养板和马丁肉汤中上能良好的生长，菌液表面形成较厚的膜，观察菌落呈针尖状，表面湿润光滑，有亮泽，凸起的圆形；在改良的B-G培养板上形成湿润光滑、半透光、中心凸起、围绕菌落有一环形β溶血环且边缘整齐的珍珠样小菌落(图2)，其分离菌与标准Bb菌株在形态结构上相符；分离菌菌液与标准的Bb诊断血清混合后呈现出肉眼可见的絮状凝结。

图1 分离菌株的显微镜观察

图2 菌落

2.2 分离株生化试验和药敏试验

生化试验显示：该菌不发酵乳糖、棉籽糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖和侧金盏花醇等；能利用硝酸盐及分解尿素；H2S、靛基质、七叶苷、明胶、吲哚、MR实验呈阴性；石蕊牛乳、V-P、动力等实验呈阳性；能反应氧化酶、接触酶、H2O2酶、过氧化物酶等。药物敏感性试验显示：分离的菌株对甲氧嘧啶、氯霉素、氟苯尼考、庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明、呋喃坦啶高度敏感；对红霉素、头孢曲松钠、多粘菌素、卡那霉素、先锋必、头孢噻肟、乙酰螺旋霉素等中等敏感；对青霉素G、磺胺间二甲氧嘧啶钠、氨苄西林、盖博斯林、阿莫西林、杆菌肽、克林霉素等不敏感。鉴定结果显示本研究所得的菌株与支气管败血波氏杆菌标准株在生化、药敏特性上相一致。

2.3 分离菌株和标准株的16S rRNA-PCR扩增

分离株和标准株均能在1 492 bp处产生与预期片段大小一致的目的条带(图3)，其测序结果与Bb16S rRNA(E06073)基因序列同源性达到了99.1%；通过BLAST比对显示，支气管败血波氏杆菌与分离株在基因序列上最近，再次表明了所分离出的菌株为兔支气管败血波氏杆菌。

2.4 PCR扩增和重组质粒的验证

用设计的引物对分离的Bb菌株和标准Bb菌株进行PCR扩增，均扩增出与预期目的一致大小约734 bp的目的片段(图4)；对重组质粒进行验证，可见到大小约800 bp特异目的条带。

图3 16S rRNA-PCR扩增结果

图4 PCR扩增结果

2.5 PCR条件优化

PCR总反应体系25 μL保持不变，当MgCl2(25 mmol/L)加量为1.0 μL、退火温度设置为58 ℃、循环数设置为30个循环时，其它反应条件不变的情况下(94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，72 ℃延伸110 s，72 ℃延伸10 min)出现特异的清晰的目的条带。

2.6 PCR特异性检测和敏感性检测

PCR特异性试验扩增结果显示仅有以兔波氏杆菌DNA为模板的反应体系扩增出了大小约为734 bp的特异性片段，其它细菌为模板均未扩增出片段，显示建立的PCR方法具有高度的特异性(图5)；PCR敏感性检测结果显示，在第8泳道，即菌液浓度为7.2×103CFU/mL时仍能扩增出目的片段(图6)。

图6 PCR敏感性检测结果

2.7 凝集法和PCR检测的对比

对鼻拭子采集的50份样本用常规的玻片凝集法检测，结果显示阳性17份，阳性率34%；PCR法检测，结果显示阳性43份，阳性率86%(表1)。

表1 凝集法与PCR检测结果的对比

3 结论与讨论

兔支气管败血波氏杆菌病是养兔场主要传染病之一，该病能降低兔只免疫力，使饲料报酬率下降，幼兔生长发育迟滞等。由于该菌表面的丝状血凝素大蛋白起着黏附作用，能使该菌在动物体内长期定居并在呼吸道大量繁殖[6-7]，从而导致持续感染，并不断向外界排病原菌，且兔支气管败血波氏杆菌血清型较多[8]，目前尚没有商品化疫苗可用，加剧了养兔场对本病的防治难度[9]。

本研究从安徽北部养兔集中地区多个疑似发生本病的大型养兔场采集病料，用常规方法进行细菌分离培养，对分离菌株形态学、血清学、生化和药物敏感性等进行了研究，并利用16S rRNA-PCR扩增技术加以验证，经鉴定此次从皖北兔场分离的菌株为兔支气管败血波氏杆菌。目前,多采用细菌学、血清学、免疫学方法检测此病菌，细菌学方法比较费时费力，也不适应于大规模检测[10]；血清学方法虽较简便，但灵敏度低，易出现假阳性现象[11]；免疫学方法存在抗原制备较为繁琐且还会出现批次差异；李峰等[12]采用16S rRNA基因序列测定方法鉴定兔支气管败血波氏杆菌;郭伟娜等[13]采用16S rRNA-PCR方法对猪源多杀性巴氏杆菌的毒力基因进行检测，但该检测方法存在局限性，RNA提取比较困难、极易降解，常用作细菌种属分类。本试验利用兔支气管败血波氏杆菌表面特有的丝状血凝素蛋白基因序列设计引物，建立了一种PCR快速诊断技术，并对PCR反应体系中的镁离子浓度、退火温度和循环次数等反应条件进行优化，确立了最佳的反应条件；同时对建立的PCR诊断方法的特异性和敏感性进行了检测，显示仅有兔波氏杆菌扩增出特异片段，在菌液浓度仅为7.2×103CFU/mL时仍能扩增出目的片段，用建立的PCR方法对宿州某肉兔场50份鼻拭子样本进行检测，阳性数43例，阳性率86%，是传统细菌凝集法的2.53倍，证明本研究建立的PCR方法具有较强特异性和高度的敏感性，同时也表明Bb在兔群中普遍存在；此诊断方法在临床应用时，无需像传统方法那样耗时耗力对菌株进行分离培养等，可直接采用煮沸法提取病菌DNA做PCR扩增就可以进行检测，所以该PCR方法具有高效准确、简捷快速、省时省力、低成本、一次可检测多个样本等优点，本研究可用于对兔支气管败血波氏杆菌病的快速诊断，为兔场对本病的及时诊断、疫病鉴别、提早预防和有效防治提供理论依据。