一种巯基氨基酸响应荧光探针的合成及检测应用

周苗苗， 杜缓缓， 赵辉轩， 朱 伟， 毛月圆

(安徽科技学院 化学与材料工程学院，安徽 凤阳 233100)

巯基氨基酸(包括半胱氨酸，高半胱氨酸，谷胱甘肽)是一种非常重要的生物分子，与生物体内多种过程有关，例如保持细胞内的还原性[1-2]，维持蛋白的立体结构等等[3-4]，因而巯基氨基酸的代谢异常与多种疾病的出现有关。例如，作为巯基氨基酸的重要代谢物，硫醇浓度的异常升高与心血管疾病及阿尔兹海默症[5]相关，而硫醇浓度的异常降低与嗜睡、肝脏损伤、皮肤损伤[6-7]等疾病相关。因此，巯基氨基酸的检测有利于疾病的早期诊断[8]。现有多种手段被用于巯基氨基酸的检测，主要包括荧光光谱手段[9]、电化学手段[10]、表面增强拉曼光谱、色谱手段及质谱手段等。在这些测试手段中，荧光光谱手段是一种简单、有效、无损伤且具有较低检测限的方法，可以被应用于细胞[11-12]、组织及活体成像中[13-14]。大多数的巯基氨基酸类荧光探针是基于化学反应的探针，主要包括磺胺键、磺酸酯键、乙酰酯键的断裂[15]，Se-Au键断裂[16]，芳香取代反应，二硫键断裂反应[17]，环化反应[18]及Michael加成反应[19]。基于化学反应的探针通常需要一定的反应时间，因此，亟需开发一种快速灵敏的荧光探针。

本项目以7-羟基香豆素为原料合成了一种巯基氨基酸荧光探针SP，并利用1HNMR，13CNMR，HRMS等手段进行表征；此探针溶液中加入GSH、Hcy及Cys后呈现出较为明显的荧光变化，并具有较高的选择性；探针SP实现了溶液中的巯基氨基酸的高选择性检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

试剂：7-羟基香豆素(98%)，2,4-二硝基氟苯(98%)，谷胱甘肽，半胱氨酸，高半胱氨酸，牛血清蛋白(BSA)，苯丙氨酸，丙氨酸，甘氨酸，谷氨酸，胱氨酸，精氨酸，赖氨酸，酪氨酸，亮氨酸，色氨酸，丝氨酸，丝氨酸，组氨酸，天冬氨酸(AR，上海泰坦科技有限公司)。仪器：AdvanceⅢ600核磁共振波谱仪(日本理学)；6200系列TOF/6500(Q-TOF B.06.01)高分辨质谱仪(美国安捷伦);RF-6000荧光光谱仪(日本岛津)。

1.2 化合物SP的合成

将7-羟基香豆素(0.016 2 g，0.100 0 mmol)加到50 mL的圆底烧瓶中，加入10 mL乙腈使其完全溶解，加入3滴三乙胺搅拌5 min，再加入2,4-二硝基氟苯(0.018 6 g，0.100 0 mmol)，在氮气保护下室温搅拌反应6 h，TLC板监测反应进度(图1)。待其充分反应后，旋干溶剂得到粗产品，通过柱层析提纯，得到淡黄色固体化合物。

图1 化合物SP的合成

1.3 溶液配制及测试方法

化合物SP溶解于DMSO中得到浓度为10-3mol/L的储备溶液;谷胱甘肽、半胱氨酸、高半胱氨酸及其他氨基酸溶解于纯水中得到储备溶液。用v(PBS)∶v(DMSO)为6∶4的混合溶剂将储备液稀释至需要的浓度进行测试,其中PBS溶液的浓度为0.05 mol/L,pH=7.4。

荧光光谱测试过程以377 nm为激发光,收集390～700 nm之间的发射光谱,数据间隔0.5 nm,扫描速度600 nm/min,激发光带宽5 nm,发射光带宽3 nm。

2 结果与分析

2.1 核磁共振谱图表征

按照1.2中合成步骤得到淡黄色化合物为探针SP(0.024 0 g,0.073 2 mmol),产率73%。1HNMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.93 (d, J=2.6 Hz, 1H), 8.45 (dd, J=9.1 Hz, 1H), 7.75 (d, J=9.6 Hz, 1H), 7.61 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.24 (d, J=9.1 Hz, 1H), 7.13-7.03 (m, 2H), 6.46 (d, J=9.6 Hz, 1H).13CNMR δ 159.80, 156.81, 155.47, 154.19, 142.78, 142.53, 140.50, 129.95, 129.07, 122.33, 120.50, 116.76, 116.43, 115.95, 108.04. HRMS:[M+Na+]=351.022 78 (理论值=351.022 4)。

2.2 光物理性质

探针分子SP中,化合物SP无荧光,但香豆素荧光团的荧光被猝灭,这是由于2,4-二硝基苯基的引入。向SP的v(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)为6∶4的溶液中逐渐加入巯基氨基酸溶液并在37 ℃下水浴1 h后,454 nm处荧光成像呈现逐渐增强的趋势(图1)。当SP溶液中所含有的巯基氨基酸(GSH、Cys或Hcy)的浓度逐渐增大时,体系的荧光强度逐渐增强;当巯基氨基酸大约为100 μmol/L时,荧光强度达到荧光平台区;向SP溶液中分别加入过量的GSH、Cys或Hcy并水浴后,分别呈现出217、178或135倍的荧光增强(图2d)。

图2 分别向化合物(10 μmol/L)v(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)为6∶4的溶液中逐渐加入不同浓度的GSH(a),Cys(b), Hcy(c)并在37 ℃水浴60 min后,溶液的荧光变化趋势;454 nm处荧光强度随巯基氨基酸浓度变化趋势(d),Ex=377 nm

Fig.2 Fluorescent spectra of probe SP (10 μmol/L) inv(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)=6∶4 after adding different concentration (0～1 000 μmol/L) of GSH (a), Cys (b) or Hcy (c) and incubating the mixture at 37 ℃ for 60 min. Fluorescence intensity at 454 nm of mixture containing 10 μmol/L SP and biothiols change as the concentration of biothiols (GSH or Cys or Hcy) increased gradually, Ex=377 nm

通过测量未加入巯基氨基酸的空白探针SP溶液的荧光强度10次,并计算测量值的标准偏差为19.96,在浓度较小时(<30 μmol/L),荧光强度随着加入的巯基氨基酸的浓度的增大呈线性变化,经过线性拟合(如图2所示)得到加入GSH、Cys和Hcy的荧光线性变化斜率分别为4 721.27、4 502.51和1 519.36。标准偏差为19.96,探针SP对GSH、Cys或Hcy 3种巯基氨基酸的检测限(LOD)分别为0.012 7、0.013 3、0.039 5 μmol/L。

2.3 响应时间

为了衡量探针SP与巯基氨基酸的响应速度,我们分别将加入过量巯基氨基酸的SP溶液水浴不同时间,并测其荧光光谱。在454 nm处得荧光强度随着水浴时间的变化趋势如图3所示,3种巯基氨基酸(GSH、Cys、Hcy)与探针SP的反应速度接近,且在混合后20 min左右荧光强度达到平台区域。此实验说明探针SP对GSH、Cys、Hcy 3种巯基氨基酸的响应过程都比较迅速。

图3 10 μmol/L的SP v(PBS(pH=7.4))∶v(DMSO)=6∶4溶液中分别加入1 000 μmol/L GSH, Cys或Hcy后,荧光强度随水浴时间的变化趋势,Ex=377 nm Fig.3 The fluorescence intensity at 454 nm containing 10 μmol/L SP and 1 000 μmol/L biothiols (GSH or Cys or Hcy) in v (PBS (pH=7.4))∶v (DMSO)=6∶4 mixed solvent change as the time prolonged at 37 ℃, Ex=377 nm

2.4 选择性

基于探针所处的环境中有可能存在其他种类的离子,因此荧光探针应该具有较好的生物选择性。向SP的溶液中加入过量的常见的氨基酸、蛋白及离子(1～22分别代表GSH、Cys、Hcy、BSA、Phe、Ala、Gly、Glu、Cystine、Arg、Lys、Tyr、Leu、Trp、Ser、Thr、Asn、His、K+、Mg2+、Cl-、Na+),并水浴后测试其荧光光谱图4所示。加入BSA、Cys和Hcy的样品的荧光呈现出明显的增强,加入其他氨基酸及离子的样品荧光未呈现出明显的增强趋势,并且含有巯基的蛋白BSA对探针SP的荧光也无明显的影响。因此,可以说探针SP的选择性很高,可用于复杂环境中检测GSH、Cys和Hcy。

图4 探针SP对其他常见氨基酸、蛋白及离子的选择性 Fig.4 Selectivity of SP to other amino acids or ions

2.5 检测机理

探针SP分子中的2,4-二硝基苯基中,由于两个硝基的吸电子作用使得苯环上1号位碳原子呈现出缺电子效应显正电性,二巯基氨基酸中的S原子具有孤对电子呈现富电子效应,具有亲核性质,进攻1号位的碳原子,O-C键断裂,与苯环相连的氧原子离去,生成具有荧光的香豆素衍生物。

图4 探针SP检测GSH、Cys、Hcy的机理

3 结论

本文报道了一种基于香豆素衍生物的巯基氨基酸(GSH、Cys和Hcy)荧光探针SP,在GSH、Cys或Hcy存在时,将呈现出明显的荧光变化,分别呈现出216、135、183倍的荧光增强;SP对GSH、Cys、Hcy的检测限较低,分别为0.012 7、0.013 3、0.039 5 μmol/L;探针SP与巯基氨基酸的响应时间为20 min。此探针具有较高的选择性,可拓展其在生物成像方面的应用。