免疫检查点在感染性疾病中的研究进展

刘亭亭 刘 红 张福仁

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院)，山东省皮肤病性病防治研究所，济南，250022

T细胞通过T细胞受体(T cell receptor, TCR)识别抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APCs)呈递的抗原释放多种效应因子，在免疫调节过程中发挥重要的作用。T细胞还表达多种共刺激性、共抑制性受体，这些受体可以提供驱动其活化或抑制的信号，在适应性免疫应答中发挥重要作用。其中，免疫抑制性受体也被称为免疫检查点，是一类免疫抑制性分子，其高表达可使T细胞发生耗竭，效应功能丧失，从而减少对肿瘤细胞、病毒或细菌的免疫监视及杀伤作用，导致肿瘤细胞或者异源微生物发生免疫逃逸[1,2]。

1 免疫检查点的分类及作用机制

目前，研究最为广泛的免疫检查点为细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4)、程序性死亡受体1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(TIM-3)、T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域(TIGIT)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)(图1)[1,3]。2018年James P Allison和Tasuku Honjo因分别发现CTLA-4和PD-1及PD-L1而被授予诺贝尔生理学或医学奖，这也使得近年来免疫检查点相关的研究备受关注。

图1 免疫检查点与其相应受体的相互作用。T细胞表面表达CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等免疫检查点，抗原递呈细胞(APC)表面表达各种免疫检查点的受体如CD80/CD86、PD-L1/PD-L2、galectin9、CD155/CD112和MHCII，免疫检查点与其相应受体结合会直接抑制效应T细胞的活性；另一方面，高表达免疫检查点的Treg细胞会通过分泌IL-10间接抑制效应T细胞的活性

CTLA-4是第一个临床靶向的免疫检查点[4]，它在T细胞上表达，与CD28共享相同的配体(CD80和CD86)，主要调节T细胞激活的早期阶段。CTLA-4可通过两种方式传递抑制性信号来调节T细胞的活性。T细胞通过TCR识别APC呈递的抗原活化后，CD28可通过与APCs上CD80和CD86的结合，进一步放大TCR信号激活T细胞。幼稚型和记忆型T细胞表面高表达CD28，而CTLA-4存在于胞内囊泡中，当TCR识别抗原后，CTLA-4被转运到细胞表面，TCR(和CD28)的信号越强，表达在T细胞表面的CTLA-4就越多。相比CD28，CTLA-4对两种配体整体亲和力更高，可竞争性与CD80和CD86结合，抑制共刺激因子CD28的活性，从而降低T细胞的活化。另一方面，CTLA-4表达于调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)表面，增强Treg细胞的抑制功能[5]。

PD-1在T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞及自然杀伤(NK)细胞表面表达，其配体是PD-L1和PD-L2，PD-1主要与PD-L1结合[6]。与CTLA-4不同，PD-1是通过效应T细胞调节组织中的炎症反应[7,8]。在慢性抗原暴露的情况下，活化的T细胞会上调炎症组织中PD-1的表达，PD-1/PD-L1信号通路的激活可抑制T细胞的增殖，抑制IL-2、IL-17、IFN-γ等效应因子的产生，促进抑制性因子IL-10的分泌[9]。PD-1也在Treg细胞上高表达，促进Treg细胞的增殖能力和抑制功能[10]。

TIM-3最早发现表达于CD4+Th1和CD8+Tc1细胞表面[11]，随后的研究表明Th17、Treg、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)均可表达TIM-3[3]。其配体是Galectin-9(Gal-9)、CEACAM1、PtdSer和HMGB1[12]。Gal-9是首个鉴定出的TIM-3配体[13]，在髓系细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、内皮细胞、肿瘤细胞和基质细胞中表达[14]，Gal-9与TIM-3的相互作用，可通过钙离子流、细胞聚集和细胞凋亡来诱导效应T细胞的耗竭和失能[3]。TIM-3+CD8+T细胞表现出耗竭的表型，其增殖能力减弱，分泌的IL-2、TNF-α和IFN-γ减少[15]；而TIM-3+Treg免疫抑制作用增强[16]。

TIGIT在多种免疫细胞如T细胞、NK细胞和Treg细胞中特异性表达[17,18]。与CTLA-4/CD28通路类似，TIGIT和CD226共享同一组配体，CD155和CD112。CD155和CD112主要在DC、成纤维细胞和某些肿瘤细胞上高表达[19]。CD226/CD155或CD226/CD112相互作用，会放大免疫细胞的活化信号。与CD226相比，TIGIT与这两种配体的亲和力更高，可以通过竞争抑制CD226与CD155的结合，使免疫抑制占据主导地位[20,21]。同样地，Treg细胞高表达TIGIT，分泌的IL-10显著升高，呈现更强的抑制功能[22]。

2 免疫检查点在感染性疾病中的研究进展

免疫检查点是免疫系统的抑制性调节分子，参与维持机体自身抗原的免疫耐受，通过与相应配体的相互作用，调节靶细胞的功能状态，在感染性疾病中发挥重要的免疫调控功能。近年来的研究发现，不只是癌症，许多病原体的感染也会促进免疫抑制受体介导的免疫细胞间的相互作用，逃避免疫控制。

在急性感染时，幼稚型CD8+T细胞迅速增殖并分化成效应CD8+T细胞，直接杀伤靶细胞，并控制感染。抗原清除炎症消退后，大多数活化的T细胞死亡；有一小部分亚群分化为记忆T细胞，下调其效应功能并获得一种类似干细胞样的生存能力，在IL-7和IL-15的驱动下进行缓慢的自我更新[27]。然而，在慢性感染的过程中，持续的抗原刺激会导致T细胞发生表型和功能变化，具体表现为持续高表达多种抑制性受体、细胞毒性作用和细胞因子分泌能力降低、细胞增殖能力减弱、转录因子的种类和表达水平改变、细胞代谢失调，以及表观遗传学、转录组学特征改变[28]。

2.1 病毒引起的慢性感染性疾病 T细胞耗竭的发现最早可追溯到1998年，Zajac等[29]观察到在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)慢性感染小鼠模型中存在一群效应功能不全的病毒特异性CD8+T淋巴细胞。随后在艾滋病病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的多种慢性感染性疾病中均检测到T细胞耗竭现象的存在：在感染HIV的病人中，大部分病毒特异性的CD8+T细胞功能受损，并且CD8+T细胞的功能损害与疾病的进展呈现正相关性[30]；在感染HCV的病人中，病毒特异性的CD8+T淋巴细胞功能下降，分泌的TNF-α和IFN-γ减少，从而导致病毒无法有效清除而持续存在[31]；在HBV感染患者中，病毒特异性T细胞反应减弱，阻碍病毒的清除和肝炎的康复[32]。

在慢性感染性疾病中，多项研究表明耗竭的T细胞往往伴随着多种抑制性受体(CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3)的高表达，并且参与调节效应性(TNF-α和IFN-γ)和抑制性(IL-10和TGF-β)细胞因子的分泌、细胞的增殖和凋亡等。

HIV感染的患者中，CD4+T细胞高表达CTLA-4，且其表达水平与疾病进展呈正相关，与CD4+T细胞产生的IL-2呈负相关；大多数HIV特异性CD4+T细胞共表达另一种抑制性免疫调节受体PD-1；体外阻断CTLA-4会增强HIV特异性CD4+T细胞的效应[33]。HIV患者CD8+T细胞表达TIM-3的比例增加，TIM-3表达水平与HIV病毒载量和CD38表达水平呈现正相关性，与CD4+T细胞数量呈负相关性；TIM-3+T细胞产生的IFN-γ减少、增殖能力下降；Stat5, Erk1/2和p38信号通路受损；阻断TIM-3信号通路则能恢复HIV特异性T细胞的增殖能力和效应水平[34]。与健康对照相比，HIV感染病人CD4+T和CD8+T细胞TIGIT表达水平明显升高，TIGIT表达高低与病毒载量和病情进展呈现相关性；与TIGIT-T细胞相比，TIGIT+T细胞高表达PD-1等共抑制受体，且细胞增殖和抗病毒免疫功能明显减弱，表现出耗竭的表型和功能特征[35,36]；单独或联合阻断TIGIT和PD-1可一定程度恢复T细胞的效应功能，但其增殖能力及IL-2分泌功能仅在联合阻断时才能恢复[35,37]。

在LCMV感染的小鼠模型中，病毒特异性CD8+T细胞高表达多种抑制受体如CTLA-4、PD-1和LAG-3等，感染的严重程度与抑制性受体表达的数量和强度呈现正相关性，体内阻断PD-1和LAG-3，可显著逆转T细胞的衰竭并控制病毒载量[38]。LCMV诱导急性感染时小鼠只会引起CD8+T细胞TIM-3的瞬时高表达，而慢性感染过程中CD8+T细胞则会持续高表达TIM-3；多种免疫器官中LCMV特异性CD8+T细胞约有65%～80%共表达TIM-3和PD-1；与TIM-3+PD-1-细胞相比，TIM-3+PD-1+细胞呈现更为严重的耗竭表型，产生的IFN-γ、TNF-α和IL-2效应细胞因子进一步减少，而分泌的抑制细胞因子IL-10却呈增长趋势；体内联合阻断TIM-3和PD-1通路可协同改善慢性感染小鼠CD8+T细胞的效应和病毒载量[39]。

在HCV感染患者中，外周血CD4+T和CD8+T细胞中TIM-3的表达水平升高，与TIM-3-T细胞相比，TIM-3+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的能力减弱，而阻断TIM-3可以改善T细胞的失能表型，促进细胞增殖和IFN-γ的产生[40]。HCV特异性CD4+T细胞中TIGIT表达水平升高，并且TIGIT主要是在效应记忆T细胞亚群中高表达；HCV特异性CD4+T细胞中大部分细胞共表达TIGIT和PD-1，使用直接抗病毒药物治疗能够显著降低HCV特异性CD4+T细胞中TIGIT和PD-1的表达强度[41]。

2.2 分枝杆菌引起的慢性感染性疾病 除病毒引起的慢性感染外，研究也发现胞内菌如分枝杆菌引起的慢性感染中也存在免疫抑制受体高表达的情况。

首先，部分企业对成本管控重视不足。受到长期发展模式的影响，现如今一部分建筑施工企业对成本管控的认知和重视依旧存在较大的不足，将更多的精力集中在经济效益的提升上。在这样的情况下，企业财务管理人员所采用的成本管控理念和方法也较为落后，缺乏事前分析，对成本材料市场发展动态关注掌握不足等，这使得建筑工程项目实施过程中出现严重的浪费现象，导致工程成本不断增加。由此可见，成本管理意识方面的落后会使企业发展不断落后，最终被市场所淘汰。

在结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染的肺结核患者中，CD8+T细胞和抗原特异性CD8+T细胞中TIM-3表达水平明显高于健康对照，且表达TIM-3的CD8+T细胞减少了IFN-γ和颗粒酶的产生，降低了增殖能力；阻断TIM-3信号通路可显著提高IFN-γ的分泌，提高T细胞的效应[42]。肺结核患者T细胞、单核细胞和B细胞均高表达PD-1及其配体PDL-1和PDL-2；体外M.tuberculosis刺激病人外周血单核细胞(PBMC)会提高T细胞、单核细胞和B细胞中PD-1、PDL-1和PDL-2的表达；阻断PD-1或是PDL-1/2会促进T细胞效应因子IFN-γ的分泌，抑制凋亡，促进增殖[43]。在M.tuberculosis诱导的结核小鼠模型中，肺部CD4+T和CD8+T细胞高表达多种免疫抑制因子如CTLA-4、 PD-1、TIM-3和LAG-3等，产生的效应细胞因子(TNF和IL-2)减少，抑制性因子IL-10增加；通过分析PD-1和TIM-3的共表达发现，TIM-3+PD-1-T细胞仍然有产生细胞因子的能力，TIM-3+PD-1+T细胞呈现出更为严重的功能衰竭；阻断TIM-3会降低菌载量，并上调细胞因子的表达水平[44]。在M.tuberculosis诱导的结核恒河猴模型中，肺部尤其是肉芽肿部位CD4+T细胞和NK细胞高表达LAG-3[45]。在SIV和M.tuberculosis共同感染的恒河猴中，淋巴结和肉芽肿中黏膜恒定T细胞PD-1和TIGIT的表达升高，产生的TNF水平下降[46]；肺部和肉芽肿中CD4+T和CD8+T细胞PD-1和TIGIT的表达升高，产生的TNF减少[47]。

在麻风分枝杆菌感染的麻风患者中，免疫检查点也可发挥类似的作用。麻风发病者的临床表现因机体免疫状态的不同呈谱状分布：一端是Th1细胞介导的结核样型麻风(TT)，病理上表现为大量的淋巴细胞浸润和少量的菌载量；另一端是Th2细胞介导的瘤型麻风(LL)，病理上表现为少量的淋巴细胞浸润和大量的菌载量[48]。与正常对照相比，体外麻风菌刺激PBMC，LL患者单核细胞CD86表达下调，TT和LL患者T细胞PD-1表达均上调[49]。与TT患者相比，LL患者外周血中Treg细胞的数量显著增多，T细胞分泌的IFN-γ减少，IL-10升高；LL患者皮损中，Treg细胞浸润增加，CTLA-4和IL-10的表达水平上调[50]。与正常对照和TT患者相比，LL患者Treg细胞中CTLA-4和PD-1表达显著上调；分别分离正常人、TT患者和LL患者的CD4+CD25+(Treg)细胞和CD4+CD25-细胞，与各自PBMC共培养，发现LL患者Treg细胞能够显著降低IFN-γ和TNF-α的产生[51]。与未感染对照相比，多菌型患者中Treg细胞数量增加，多菌型和少菌型患者Treg细胞中PD-1表达水平升高；与少菌型患者相比，多菌型患者Treg细胞产生的IL-10显著减少[52]。最新研究也发现在麻风皮损中，CD8+T细胞高表达TIGIT和LAG-3，表现出细胞激活和抗凋亡有关信号通路紊乱等耗竭的表型[53]。

综上，CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3免疫检查点是免疫系统中的抑制性调节分子：一方面，在T细胞中高表达，可直接诱导效应T细胞的耗竭；另一方面在Treg中高表达，增强Treg细胞的免疫抑制功能，间接性的调节效应T细胞的功能。

3 临床应用

病原体如结核分枝杆菌可通过诱导PD-1等免疫抑制受体的高表达实现免疫逃逸。因此，多项研究表明靶向免疫检查点可以调节慢性感染性疾病的进程[54]。

3.1 PD-1/PDL-1靶点在结核治疗中的研究 在新发肺结核的患者中，PD-1+T细胞比例和PD-1平均荧光强度均与菌载量密切相关；在抗结核治疗期间，PD-1+T细胞的比例逐渐下降，并逐渐恢复到健康人水平；在体外抗原诱导的细胞因子实验中，PD-1+T细胞的数量与IFN-γ和IL-4的分泌呈负相关[43]。与结核分枝杆菌潜伏期感染者相比，结核患者中M.tuberculosis特异性CD4+T细胞中PD-1的表达水平显著升高，而在抗结核治疗后降低；而M.tuberculosis特异性CD8+T细胞在感染和疾病过程中无差异；体外刺激PBMC，具有增殖能力的M.tuberculosis特异性CD4+T细胞高表达PD-1[55]。结核病人PBMC中Treg细胞比例明显升高；在各种CD4+T细胞亚群如Treg、Tresp(CD4+CD25-)和Teff(CD4+CD25+Foxp3-)细胞PD-1和PD-L1的表达显著升高；经有效的抗结核治疗后Tresp和Teff细胞中PD-1的表达显著下降[56]。这些研究表明，评估PD-1在抗原特异性CD4+T细胞上的表达水平可以作为人类结核病细菌负荷和治疗反应的潜在生物标志物，CD4亚群中PD-1/PD-L1通路的调节可能为控制肺结核提供一个免疫治疗靶点。

以上这些研究提示阻断PD-1/PD-L1或许可以通过缓解T细胞功能障碍来有效地促进结核病人的免疫应答[54]。例如，Ishii等[57]发现，一例IV期非小细胞肺癌患者经紫杉醇/卡铂/贝伐单抗治疗后左上肺出现分枝杆菌诱导的播散性病灶结节，nivolumab(抗PD-1抗体)治疗两个月后改善了结节的肿大，表明nivolumab既能抑制肿瘤的生长，还有效地治疗分枝杆菌感染。

然而，ipilimumab、nivolumab和pembrolizumab等免疫检查点抑制剂在重新激活免疫系统的同时，也可能引发多种自身免疫不良反应。例如，一例晚期肺腺癌患者，nivolumab治疗3个月后诱发结核性心包炎[58]；一例鼻咽癌患者nivolumab治疗3个周期后死于播散性肺结核；一例默克尔细胞癌患者pembrolizumab治疗11个周期后右下肺叶新发结节[59]；一例高表达PDL-1的非小细胞肺癌患者pembrolizumab治疗6个周期后检测到了M.tuberculosis的感染[60]；另一例非小细胞肺癌患者经nivolumab治疗后诱发了肺结核[61]。

同样地，在体内模型中，以PD-1/ PDL-1为靶点的实验，也不能有效地抑制结核分枝杆菌的生长。在M.tuberculosis感染的结核小鼠模型中，M.tuberculosis特异性CD4+T细胞过度产生IFN-γ，促进结核发展，导致PD-1基因敲除小鼠的死亡[62,63]；Lazar-Molnar等[64]也发现PD-1缺陷型小鼠的存活率显著降低，肺部菌载量显著增多，肺部出现过度炎症反应及大面积组织坏死，血清中促炎细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-17显著升高；PD-1缺失提高Treg细胞数量并抑制M.tuberculosis特异性T细胞的增殖，从而导致PD-1缺陷型小鼠对M.tuberculosis的易感性增加[65]。在M.tuberculosis感染的恒河猴中，使用抗PD-1单克隆抗体治疗的动物疾病程度更为严重，肉芽肿中细菌载量更高；阻断PD-1尽管能够增加肉芽肿中M.tuberculosis特异性CD8+T细胞的数量和功能，却不能提高CD4+T细胞的效应，反而会提高其CTLA-4的表达水平；PD-1抗体治疗组的肉芽肿中多种促炎性细胞因子分泌增多，且与菌载量呈现正相关性[66]。这些结果表明PD-1缺失会引起CD4+T细胞过度的炎症反应，而不利于宿主控制结核分枝杆菌的生长。

过量或过度活跃的TNF-α、IFN-γ或叠加其他细胞因子，可能会促进肉芽肿中央坏死导致空洞形成，使感染快速播散，有利于M.tuberculosis的生长。在体外M.tuberculosis感染PBMC体系中，spartalizumab(抗PD-1抗体)抑制PD-1信号通路可促进M.tuberculosis的生长，上调细胞因子的分泌，而中和TNF-α可减缓结核分枝杆菌的生长；结核病人肺部TNF-α表达升高，且PBMC中CD4+T细胞PD-1的表达水平与痰液TNF-α的浓度呈负相关，表明抑制PD-1可通过上调TNF-α的分泌加速M.tuberculosis的生长[67]。这些结果提示TNF-α可能是PD-1治疗引发结核的主要驱动因子，抗PD-1抗体引发的免疫相关不良事件或许可以采用抗TNF-α抗体进行治疗。

3.2 CTLA-4靶点在结核治疗中的研究 与PD-1抑制剂不同，尽管Elkington等[68]报道1例眼部黑素瘤患者在先后接受CTLA-4抑制剂和PD-1抑制剂治疗后出现了活动性的肺结核，目前尚无单独使用CTLA-4抑制剂治疗诱发结核的病例报道。同样地，在牛分枝杆菌感染的小鼠模型中，体内阻断CTLA-4，会诱导淋巴结中抗原特异性淋巴细胞的扩增和分化，但并不能影响肺部CD4+T、CD8+T和B细胞的数量及IFN-γ的产生，因此阻断CTLA-4不会影响菌载量及结核的进展[69]。

3.3 免疫检查点在艾滋病治疗中的研究 对于其它感染性疾病如艾滋病，双重PD-1和IL-10阻断通过恢复HIV特异性CD4+T细胞功能来增强NK细胞效应因子的分泌和脱颗粒来杀伤靶细胞，这提示免疫检查点抑制剂能够改善CD4+T/NK细胞合作，可用于HIV感染的辅助治疗[70]。在一项I期临床试验中，Uldrick等[71]首次在患有晚期癌症的HIV感染者中检测pembrolizumab的安全性，发现尽管可能会引起卡波西肉瘤疱疹病毒相关的B细胞增殖，pembrolizumab单抗具有可接受的安全性。迄今为止，已有各种免疫检查点抑制剂方案如pembrolizumab、nivolumab、ipilimumab和nivolumab联合、ipilimumab、ipilimumab和pembrolizumab联合、atezolizumab、avelumab、durvalumab等用于患有黑素瘤、肺癌、默克尔细胞癌和卡波西肉瘤的HIV感染者上，它们引起的副作用也在可控范围内，提示这些药物治疗的安全性[72]。此外，TIM-3、LAG-3和TIGIT也可以作为治疗HIV感染者的潜在靶标[73]。

4 展望

免疫检查点(CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等)表达于免疫细胞表面，可触发免疫抑制信号通路，对于维持自我耐受和调节免疫效应具有重要意义。免疫检查点信号可导致效应T细胞进入一种被称为“耗竭”的状态，并减弱其免疫反应。近年来的研究发现，不只是肿瘤，许多病毒和胞内菌的持续性感染也会促进免疫检查点介导的免疫细胞间的相互作用，导致免疫逃逸。尽管靶向免疫检查点的阻断剂也已作为抗菌药物的辅助剂应用于艾滋病和结核病等的治疗，其在感染性疾病中的应用依然存在争议。因此，深入研究免疫检查点与疾病的相关性，将有助于理解其在感染性疾病诊断、预后评价、治疗和疗效监测中的意义。