HIF-1α调控4-羟基他莫昔芬对乳腺癌MCF-7细胞敏感性的研究

陈宗跃，张璟钰，张敏琴，樊双琴，沈祥春，陈 妍，张 玥

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，75%的恶性乳腺肿瘤患者呈现雌激素受体α(estrogen receptor-α，ERα)阳性[1]。他莫昔芬(tamoxifen, TAM)是原发性ERα阳性乳腺癌的核心治疗药物，临床数据显示约50%的反应性乳腺肿瘤因长期使用TAM而产生抗性并导致治疗失败[2]。低氧诱导因子1α(hypoxia induced factor 1α, HIF-1α)是细胞在低氧状态下稳定表达的核转录因子[3]，其可调控多种耐药靶基因的表达从而致使肿瘤细胞的化疗耐药。目前已有研究[4]表明HIF-1α水平升高与多种恶性肿瘤耐药有关，但其与乳腺癌TAM耐药的关系目前尚不明确。因此，该研究采用TAM的活性代谢物4-羟基他莫昔芬(4-hydroxy tamoxifen，4-OHT)构建乳腺癌TAM耐药细胞模型，探讨HIF-1α与乳腺癌TAM耐药的关系，为攻克乳腺癌耐药问题寻找新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂人乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院昆明细胞库；4-OHT购自美国Abcam公司；FG-4592及LW6均购自上海MedChem Express公司；MTT购自北京索莱宝公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司；si-HIF-1α和阴性对照si-NC序列均购自上海吉玛公司，Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；抗HIF-1α购自美国Sigma公司；β-actin单克隆抗体购自美国Bioworld公司；二抗羊抗兔/羊抗鼠购自上海斯信生物科技有限公司；一抗稀释液/二抗稀释液均购自上海碧云天生物有限公司。

1.2 主要仪器LDZX型立式高压蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1型超净工作台购自苏州净化设备有限公司；Heal force型细胞培养箱购自上海力申科学仪器有限公司；CFX型凝胶成像系统购自美国Bio-rad公司；3020-426型多功能酶标仪购自美国Thermo公司；NovoCyte 3008型流式细胞仪购自美国艾森生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1构建耐药细胞 将MCF-7细胞培养于37 ℃，5 % CO2的培养箱中，细胞传代贴壁后加处理因素。MCF-7/TR通过浓度梯度法诱导获得，将4-OHT浓度从1 μmol/L逐渐提高到5 μmol/L，筛选6个月，待细胞生长稳定后，通过给予MCF-7和MCF-7/TR细胞不同浓度4-OHT(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)作用24 h后，用MTT法检测细胞的耐药性。后配制含5 μmol/L的4-OHT和10 %胎牛血清的DMEM培养基常规培养耐药细胞以继续维持其耐药性。耐药指数(resistance index, RI)=IC50(MCF-7/TR)/IC50(MCF-7)。

1.3.2MTT法检测细胞存活率 将乳腺癌MCF-7亲本细胞或MCF-7/TR细胞分别接种于不同96孔板内(1×104个/孔)，培养24 h后，分别给予不同组MCF-7/TR细胞4-OHT(5、10、20 μmol/L)联合LW6(15 μmol/L)作用24 h、FG-4592(25 μmol/L)联合不同浓度4-OHT(5、10、20 μmol/L)作用24 h以及给予沉默HIF-1α蛋白MCF-7/TR细胞不同浓度4-OHT(5、10、20 μmol/L)作用24 h后，加入20 μl/孔的MTT孵育4 h，于酶标仪波长490 nm处测吸光度值，计算各浓度药物下的抑制率(inhibition rate, IR)，并绘制细胞生长抑制曲线，实验重复3次，每组设置5个复孔。IR=[(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值]×100 %。

1.3.3Western blot法检测蛋白表达 将药物处理24 h后的MCF-7/TR或MCF-7细胞用RIPA裂解液加蛋白酶抑制剂裂解细胞20 min后收集上清液，采用BCA蛋白含量检测试剂盒测定各组蛋白浓度并按照40 μg共20 μl上样各组蛋白进行电泳、转膜、封闭。封闭完成后按照抗体说明书稀释一抗，4 ℃孵育过夜，恢复至室温后加入TBST洗涤3次，每次10 min。加入二抗室温孵育90 min后再次洗膜，曝光，采用自动凝胶成像系统(Bio-Rad)进行成像，所得数据使用Image Lab分析软件进行One-way ANOVA分析。

1.3.4siRNA实验探讨HIF-1α蛋白对MCF-7/TR细胞耐药的影响 将对数生长期的MCF-7/TR细胞接种于6孔板中，培养至融合率达到50%～60%，根据转染说明书，使用Lipofectamine 2000试剂进行转染，si-HIF-1α和si-NC的转染浓度为0.1μmol/L。细胞转染6 h后，采用含有10% FBS的DMEM高糖培养基换液，继续培养48 h，提取总蛋白进行敲除效果验证。细胞抑制率实验在转染48 h后给予不同浓度4-OHT(5、10、20 μmol/L)作用24 h后进行细胞存活率检测。

1.3.5流式细胞术检测细胞凋亡率 用不含EDTA的胰酶消化各给药组细胞，收集细胞悬液，2 000 r/min离心5 min后弃去上清液，用1×PBS缓冲液洗涤细胞2次，再以2 000 r/min离心5 min收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书加入500 μl Binding Buffer悬浮细胞，先加入5 μl AnnexinV-FITC 混匀后，再加入5 μl PI溶液，在室温条件下避光反应 15 min后上流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 构建乳腺癌TAM耐药细胞系MCF-7/TR给予MCF-7和MCF-7/TR细胞不同浓度4-OHT(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L)作用24 h后，MTT法检测4-OHT对MCF-7/TR细胞和MCF-7亲本细胞的生长抑制作用。结果显示，与MCF-7细胞相比，MCF-7/TR细胞对4-OHT的抵抗性增强(P<0.05)，其RI值为(5.56±0.80)(图1)。

图1 4-OHT对MCF-7和MCF-7/TR 细胞的生长抑制影响与MCF-7/TR组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.2 HIF-1α表达与乳腺癌细胞MCF-7他莫昔芬耐药之间的关系按照实验分组(MCF-7，MCF-7+4-OHT，MCF-7/TR，MCF-7/TR+4-OHT)分别给予MCF-7和MCF-7/TR细胞4-OHT(1 μmol/L)作用24 h。Western blot结果显示，与未给药处理的亲本细胞MCF-7相比，MCF-7/TR细胞中HIF-1α蛋白表达上调(F=13.46，P<0.05)；与未处理组 MCF-7/TR细胞比较，低剂量的4-OHT可上调MCF-7/TR细胞中HIF-1α蛋白的表达(F=12.54，P<0.05)(图2)，提示乳腺癌TAM耐药可能与HIF-1α表达上调有关。

图2 MCF-7和MCF-7/TR 细胞中HIF-1α的表达情况

2.3 HIF-1α抑制剂LW6对MCF-7/TR耐药细胞的影响Western blot结果显示，与空白对照组(Control组)比较，给予MCF-7/TR细胞LW6(15 μmol/L)作用后，HIF-1α蛋白表达减少(F=20.76，P<0.05)(图3A)；MTT结果显示，在给予MCF-7/TR细胞不同浓度4-OHT(5、10、20 μmol/L)联合LW6(15 μmol/L)处理后，LW6可提高4-OHT对MCF-7/TR的抑制率，LW6+5 μmol/L 4-OHT(F=12.51，P<0.05)、LW6+10 μmol/L 4-OHT(F=48.07，P<0.01)、LW6+20 μmol/L 4-OHT(F=31.71，P<0.01)(图3B)；流式细胞术检测结果显示，与单用4-OHT(5 μmol/L)组相比，LW6(15 μmol/L)联合4-OHT(5 μmol/L)组细胞凋亡率增加(F=15.49，P<0.05)(图3C)，结果提示抑制HIF-1α可增加乳腺癌TAM耐药细胞MCF-7/TR的化疗敏感性。

图3 HIF-1α抑制剂LW6对MCF-7/TR细胞的影响

2.4 沉默HIF-1α蛋白对MCF-7/TR细胞对4-OHT的敏感性的影响Western blot实验结果显示，与si-NC组比较，si-HIF-1α能有效敲除MCF-7/TR细胞中HIF-1α蛋白(F=56.04，P<0.01)(图4A)；MTT结果显示，与空白对照组比较(si-NC)，沉默HIF-1α可增强不同浓度4-OHT(5、10、20 μmol/L)对MCF-7/TR细胞的生长抑制作用，si-HIF-1α+5 μmol/L 4-OHT(F=45.86，P<0.01)、si-HIF-1α+10 μmol/L 4-OHT(F=37.86，P<0.01)、si-HIF-1α+20 μmol/L 4-OHT(F=36.61，P<0.01)(图4B)；流式细胞术检测结果显示，与si-NC+4-OHT(5 μmol/L)相比，si-HIF-1α可增强4-OHT对MCF-7/TR细胞的抑制作用，细胞凋亡率增加(F=12.99，P<0.05)(图4C)，结果表明HIF-1α是促进乳腺癌TAM细胞MCF-7/TR耐药的重要途径。

图4 沉默HIF-1α对MCF-7/TR细胞的影响

2.5 HIF-1α稳定剂FG-4592对4-OHT抑制MCF-7细胞生长的影响Western blot结果显示，与空白对照组相比，FG-4592(25 μmol/L)可上调MCF-7细胞中HIF-1α蛋白表达(F=16.76，P<0.05)(图5A)；MTT结果显示，与单独使用4-OHT相比，FG-4592(25 μmol/L)联合不同浓度4-OHT(5、10、20 μmol/L)可降低4-OHT对MCF-7细胞的抑制率，FG-4592+5 μmol/L 4-OHT(F=10.49，P<0.05)、FG-4592+10 μmol/L 4-OHT(F=41.59，P<0.01)、FG-4592+20 μmol/L 4-OHT(F=105.80，P<0.05)(图5B)；流式细胞术检测结果显示，与单用4-OHT(5 μmol/L)组相比，4-OHT(5 μmol/L)+FG-4592(15 μmol/L)组细胞凋亡率降低(F=16.35，P<0.05)(图5C)。

图5 HIF-1α稳定剂FG-4592对MCF-7细胞的影响

3 讨论

乳腺癌为激素依赖性肿瘤，研究显示雌激素可刺激乳腺癌细胞的生长和增殖，在乳腺癌的发生、发展及侵袭、转移中发挥重要作用[5]。目前，临床主要应用手术、放射治疗、全身治疗和辅助内分泌治疗等方式对乳腺癌患者进行治疗，其中，内分泌治疗是ER阳性乳腺癌的重要治疗方式，临床应用中显示其具有低毒、预后效果和耐受性好等特点。但在内分泌治疗过程中，其疗效因耐药性而受到了限制。研究[6]显示，最初对TAM治疗有反应的ER阳性乳腺癌在长期治疗期间敏感性逐渐降低，甚至出现复发和转移，形成继发性耐药，由于TAM耐药性的出现，治疗效果的降低，临床上乳腺癌病死率逐年递增。因此，探讨乳腺癌TAM耐药机制具有重要的研究意义。

TAM耐药的发生与乳腺癌细胞异常代谢激活、ER功能和表达的丧失以及基因表达谱的改变密切相关[7]。近年来研究[8-9]显示TAM的活性形式4-OHT可诱导HK-2蛋白高表达促进MCF-7细胞对4-OHT抵抗，同时研究显示脯氨酰羧肽酶(PRCP)活性的增加也介导了4-OHT的耐药过程，但是其确切的耐药机制仍需探索。既往研究[10]表明，HIF-1α在肿瘤细胞中的水平升高与病死率、癌症进展和抵抗治疗有关，且其表达与ERα阳性乳腺癌患者内分泌治疗耐药呈正相关[11]。HIF-1α在常氧条件下会被脯氨酸羟化酶(PHD)羟基化，再被VHL肿瘤抑制蛋白复合物识别后通过泛素蛋白酶途径降解[12]。而在乳腺癌耐药细胞中，即使是常氧条件，HIF-1α也呈现高表达[13]，而HIF-1α是否影响耐药细胞对4-OHT敏感性仍不清楚。为了探讨HIF-1α与乳腺癌MCF-7细胞4-OHT耐药之间是否存在联系，该研究采用免疫印迹分析MCF-7/TR细胞及其亲本细胞中HIF-1α的表达水平，研究表明HIF-1α在MCF-7/TR细胞中高表达，而在亲本细胞中几乎不表达。在给予低剂量的4-OHT作用后，MCF-7/TR细胞中HIF-1α水平进一步增加，这提示HIF-1α可能参与乳腺癌细胞对4-OHT的耐药过程中。目前已有研究[14]表明抑制HIF-1α表达可体外抑制乳腺癌耐药蛋白并增加肿瘤细胞的化学敏感性。为了验证这一结论，该研究向MCF-7/TR细胞中加入HIF-1α抑制剂、MCF-7细胞中加入HIF-1α稳定剂，同时采用小分子siRNA干扰技术和流式细胞术探讨4-OHT对MCF-7/TR细胞影响。结果显示，在敲除HIF-1α蛋白或者加入HIF-1α抑制剂后，4-OHT对MCF-7/TR生长抑制作用增强，细胞凋亡率增加；而在MCF-7细胞中加入稳定剂FG-4592后，4-OHT对MCF-7生长抑制作用减弱，细胞凋亡率降低。

综上所述，该研究表明HIF-1α在4-OHT耐药乳腺癌MCF-7/TR细胞中具有重要作用，抑制HIF-1α表达可增加MCF-7/TR细胞对4-OHT的敏感性，因此，HIF-1α有望成为乳腺癌TAM耐药治疗的新靶点。但是，该研究对于HIF-1α调控乳腺癌4-OHT耐药的详细机制尚未阐明，还需进一步研究。