miR-409-3p和Rab10在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达和临床意义

蔡青照，艾丽梅

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一种形态上中等至大的B细胞淋巴瘤，约占全球新诊断淋巴瘤的1/3，是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)中最常见的类型[1]。miRNA是一种长链非编码RNA，通过与下游基因的3′-UTR结合抑制转录后的翻译[2]。研究表明miRNA已经成为癌症进展中的重要参与者,可以抑制或促进肿瘤的发展，在肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移和分化等多种生物学过程中都发挥重要作用，但miR-409-3p在DLBCL中的研究较少报道。因此，该研究通过调节miR-409-3p在DLBCL细胞中的表达，来检测其对肿瘤细胞凋亡能力以及Rab10表达水平的影响，然后进一步检测Rab10在DLBCL和淋巴结反应性增生(reactive hyperplasia of lymph nodes, RHL)组织中的表达差异并分析Rab10与DLBCL患者临床特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床患者数据和细胞株来源 选取该院初诊为DLBCL的患者83例，其中男性35例，女性48例，年龄(61.6±12.7)岁，所有病例术前均未行放化疗或任何其他抗肿瘤治疗，所有患者都有完整的临床和随访数据。对照组是对同时段在该院血液科诊断为RHL的20例患者，无任何恶性肿瘤病史，所有患者在参与研究前都必须签署知情同意书，人DLBCL细胞株OCI-ly7购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.1.2主要试剂 miR-409-3p mimic、mimic NC、miR-409-3p inhibitor和inhibitor NC购自江苏凯基生物技术股份有限公司，Lipofectamine3000、Opti-MEM细胞培养基和TRIzol购自美国Thermo Fisher科技公司，三氯甲烷和异丙醇购自南京化学试剂有限公司，cDNA第一链合成试剂盒、One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit II (SYBR Green)、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and TB Green® qRT-PCR User Manual和TB Green® Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) 购自日本 TaKaRa公司，CCK-8和Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司，Rab10兔抗人多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1转染 使用Lipofectamine3000转染OCI-ly7细胞，转染前1 d，接种细胞至6孔板中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到70%～80%。将使用无血清培养基Opti-MEM稀释过的miRNA和Lipo3000混合，室温孵育20 min后加入到含有细胞的培养孔中，培养4～6 h后将孔中含miRNA-lipo3000 混合液的培养基移去，更换新鲜培养基，最后将培养板置于37 ℃的CO2培养箱中继续培养48 h后收集细胞进行下一步实验。

1.2.2荧光定量PCR(qRT-PCR)实验 用TRIzol从转染后收集的细胞中提取总RNA，在分光光度计上测量RNA浓度及纯度，OD260/OD280在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。然后以总RNA为模板，逆转录合成cDNA产物，最后通过使用实时荧光定量PCR仪95 ℃ 5 min×1个周期，95 ℃、15 s，60 ℃、20 s和72 ℃、40 s×40个周期,分别以U6和GAPDH为内参，绘制PCR产物的扩增曲线和熔解曲线。数据使用2-ΔΔCt计算miRNA或mRNA的相对表达量。实验中用到的引物见表1。

表1 qRT-PCR实验中使用到的引物

1.2.3Western blot实验 分别取空白对照组(control组)、miR-409-3p mimic组、mimic NC组、miR-409-3p inhibitor组和inhibitor NC组转染48 h后的细胞，加入蛋白酶抑制剂和RIPA裂解液提取总蛋白，使用Bradford法进行蛋白定量。然后开始配分离胶和浓缩胶，待胶成形后拔掉梳子加入适量蛋白和Marker到上样孔中，开始电泳。参照预染Marker的位置，待目的条带进入凝胶最佳分离区(大约凝胶的2/3)时，停止电泳，开始转膜，转膜结束后使用5%脱脂奶粉封闭、TBST洗涤3次后加入一抗4 ℃孵育过夜。次日TBST洗涤后加入5%脱脂奶粉稀释后的二抗，反应结束后TBST洗涤最后进行蛋白显影。

1.2.4CCK-8实验 将细胞配成5×104个/ml的细胞悬液，在96孔细胞培养板中每孔加入100 μl细胞悬液；将96孔细胞培养板置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养48 h后每孔加入10 μl CCK-8，在培养箱继续培养2 h，酶标仪检测450 nm处每孔的OD值，计算抑制率，抑制率(%)=(阴性对照组-实验组)/阴性对照组。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡 转染48 h后收集5×105个细胞，加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5 μl Annexin V-APC混匀后，加入5 μl 7-AAD，混匀；室温、避光、反应10 min；用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。

1.2.6免疫组化(immunohistochemical，IHC)实验 石蜡切片首先置于60 ℃烤片机中烘烤40 min，然后经二甲苯和梯度乙醇脱蜡至水，枸橼酸钠进行抗原修复，自然冷却至室温后加入过氧化物酶阻断剂室温孵育15 min，PBS冲洗，滴加封闭用正常山羊血清室温孵育20 min,勿洗滴加一抗湿盒中4 ℃孵育过夜，次日取出湿盒室温下复温40 min，PBS冲洗，滴加生物素标记山羊抗兔IgG聚合物孵育20 min，PBS冲洗，滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液室温孵育20 min，PBS冲洗后滴加新鲜配置的DAB显色液5 min，自来水冲洗，显微镜下观察染色结果，苏木精染液复染，盐酸乙醇分化，最后经逆浓度乙醇脱水，二甲苯透明后中性树胶封固。

1.2.7IHC结果判定 分别在100倍和200倍显微镜下为每个样本随机选择了至少3个高质量染色区域，并由2名经验丰富的病理学家以盲法评估载玻片，Rab10的表达用半定量免疫反应性评分 (IRS) 法对染色结果进行评估[3]，每张切片染色深浅程度为：无着色，0分；浅黄色，1分；棕黄色，2分；深棕色，3分。蛋白阳性表达的细胞比例为无阳性表达0分，阳性表达小于25%记1分，阳性表达25%～50%记2分，阳性表达大于50%记3分。最终得分=染色程度得分×蛋白阳性表达的细胞比例得分，最终得分≤3分为低表达，得分>3分为高表达。

2 结果

2.1 OCI-Ly7细胞转染后miR-409-3p和Rab10的表达变化转染mimic NC (t=1.952,P=0.067 8)和inhibitor NC(t=1.179,P=0.099 4)较control组差异无统计学意义；而转染miR-409-3p mimic后与mimic NC组相比，miR-409-3p的表达增加(t=24.98,P<0.000 1)；转染miR-409-3p inhibitor 后与inhibitor NC组相比，miR-409-3p的表达降低(t=28.67，P<0.000 1)。过表达miR-409-3p后Rab10的mRNA(t=21.54,P<0.000 1)和蛋白(t=13.53,P=0.000 2)表达量较mimic NC组增加，而沉默miR-409-3p的表达后Rab10的mRNA(t=12.69,P<0.000 1)和蛋白(t=8.909,P=0.000 9)表达量较inhibitor NC组则降低(P<0.000 1)，差异均有统计学意义。见图1。

图1 miR-409-3p的转染效率及对Rab10的影响

2.2 miR-409-3p对OCI-Ly7细胞增殖的影响过表达miR-409-3p抑制细胞生长，吸光度较mimic NC组降低(t=33.44,P<0.000 1)；沉默miR-409-3p促进细胞生长，吸光度较inhibitor NC增加(t=26.30,P<0.000 1)。见图2。

图2 miR-409-3p对DLBDL细胞增殖能力的影响

2.3 miR-409-3p对OCI-Ly7细胞凋亡的影响转染miR-409-3p mimic后细胞的凋亡率与转染mimic NC组相比增加(t=64.34,P<0.000 1)；转染miR-409-3p inhibitor组的细胞凋亡率比转染inhibitor NC组低，差异有统计学意义(t=8.579，P=0.001)。见图3。

图3 miR-409-3p对DLBDL细胞凋亡能力的影响

2.4 Rab10在DLBCL和RHL患者组织中的表达差异Rab10在各种膜结构、囊泡和细胞骨架中(https://www.uniprot.org/)表达，表现为棕黄色颗粒，大小形态不等(图4)，在DLBCL组织中的高表达率为 54.2%(45/83),在RHL组织中的高表达率为25%(5/20)，差异有统计学意义(P=0.019)。见表2。

图4 Rab10在DLBCL和RHL组织中的表达

表2 Rab10在DLBCL和RHL患者中的表达[n(%)]

2.5 Rab10的表达与临床病理特征的关系高水平的LDH和β2微球蛋白水平以及IPI评分高的患者Rab10表达量高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 Rab10与DLBCL患者临床特征的关系[n(%)]

3 讨论

尽管利妥昔单抗时代到来之后，DLBCL患者的治愈率得到了显著提高，但仍有20%～30%的患者治疗后会出现复发[4]。miRNA作为一种新的肿瘤标志物在肿瘤的多种生物学功能中都发挥着重要作用，它通过与下游靶基因的特定序列结合抑制靶基因的表达。有报道[5]表明在复发的DLBCL患者中miR-409-3p的水平下降，miR-409-3p可以促进DLBCL细胞对利妥昔单抗和阿霉素的药物敏感性，但miR-409-3p对DLBCL细胞增殖和凋亡能力及机制研究还未见报道，该研究使用TargetScan 7.2和miRDB预测miR-409-3p的下游靶基因，结果显示miR-409-3p与Rab10存在互补序列，说明Rab10可能是miR-409-3p的下游靶基因，Rab10可能接受miR-409-3p的调控。Rab10作为RAS超家族中的成员，是细胞内膜运输的关键调节剂。以往的研究[6]主要集中在Rab10在囊泡运输中的作用，近年来Rab10在肿瘤的研究开始得到重视，有研究[7]表明Rab10在肝癌细胞中高表达，并且与肝癌患者的不良预后相关。此外Rab10在宫颈癌[8]、神经胶质瘤[9]和食管鳞状细胞癌[10]中都起到致癌基因的作用，但Rab10在DLBCL中表达和临床关系尚不清楚。有研究[11]显示Rab10在白血病中表达增加，参与了白血病细胞的生长；DLBCL是一种起源于血液系统的有高度异质性的恶性肿瘤，它的发病机制和治疗靶点与其他血液恶性疾病有许多共通之处，因此，该研究进一步分析了Rab10与DLBCL患者的关系。

该研究首先在细胞水平上过表达和沉默miR-409-3p来观察细胞生长活性的变化，结果显示miR-409-3p能促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖。这与以往的研究[12]结果一致，miR-409-3p在绝大多数肿瘤中都被认为是抑癌基因，例如miR-409-3p在宫颈癌、卵巢癌、甲状腺乳头状癌、非小细胞肺癌等都表现为抑癌作用。进一步分析miR-409-3p和Rab10的关系，表明miR-409-3p对Rab10有促进作用。

为了更好地探讨Rab10与DLBCL患者的关系，分别检测在DLBCL和RHL患者中的Rab10水平，结果显示Rab10在DLBCL患者的表达上调，进一步分析Rab10和患者的临床资料的关系，表明在高水平的LDH、高水平β2微球蛋白及IPI评分高的患者中Rab10的表达量都有相对较高的趋势，LDH水平[13]和IPI评分[14]与淋巴瘤患者的预后密切相关，血清β2微球蛋白是影响淋巴瘤预后的独立危险因素[15]，这说明高水平Rab10的DLBCL患者肿瘤负荷更重、预后更差，这与以往的研究[16]结果也是一致的，Rab10在肿瘤患者的表达升高，与远期并发症和不良预后有关。