不同冲泡温度下滁菊茶汤HPLC指纹图谱的研究

张俊巍 韩月婷 吕伯龙 王伟 张承 于士军

摘 要：以滁菊为原料，分别在6种不同温度下冲泡，建立滁菊茶汤的HPLC指纹图谱，利用化学计量学方法进行分析。结果表明，滁菊茶汤品质与冲泡温度有关，18个样品有6个共有峰。主成分分析提取了两大主成分，其累积贡献率达到93.187%。聚类分析可将样品分为3类，分别为50℃和60℃，70℃、80℃和90℃，100℃。随着温度升高，茶汤颜色越浓，活性物质含量越高，茶汤品质也越好。冲泡温度为100℃时，茶汤品质最佳。为合理沖泡和饮用滁菊茶提供参考和科学依据。

关键词：滁菊;指纹图谱;冲泡温度;茶汤品质

中图分类号 TS275 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）11-0125-05

Study on the HPLC Fingerprint of Chrysanthemum morifolium （Ramat） Tzvel. cv. Chuju Tea Soup Brewed at Different Temperatures

ZHANG Junwei1   HAN Yueting2   LV Bolong3   WANG Wei1   ZHANG Cheng1   YU Shijun2

（1Agricultural Products Quality and Safety Center，Xuancheng City，Xuancheng 24200， China 2Chuzhou Academy，Chuzhou City， Chuzhou 239500， China; 3Anhui Tuowei Testing Services Co.， Ltd.，Xuancheng City，Xuancheng 24200，China）

Abstract： The HPLC fingerprints and antioxidant activities of C. morifolium （Ramat） Tzvel. cv. Chuju tea soup were studied by brewing Chuju tea at 6 different temperatures. The fingerprints were analyzed by chemometrics . The results showed that the quality of Chuju tea soups had a good relationship with the brewing temperature significantly. There are 6 common peaks in the fingerprints of 18 samples .Cluster analysis can divide samples into three categories， namely 50℃ and 60℃， 70℃， 80℃ and 90℃， and 100℃. When the brewing temperature is 100℃， the quality of tea soup is the best. Provide reference and scientific basis for reasonable brewing and drinking of Chuju tea.

Key words： Chuju; Fingerprint; Brewing temperature; The quality of tea soup

菊花是一种常见的药食两用的花卉，广泛应用于中医临床和生活食品。滁菊（Chrysanthemum morifolium（Ramat）Tzvel. cv. Chuju）是多种菊花中效用最为优质的品种。滁菊的生产地区主要在滁州，拥有数百年的栽培历史[1]。滁菊是当地特色植物资源，也是当地特产，是国家的地理标志性产品。滁菊又可以被叫为“白菊”、“甘菊”，位列中国“四大药菊”之一[2]。经我国的卫生部批准，滁菊是药食兼优植物，它有很高的药用保健价值。滁菊在生活中主要为茶冲泡饮用，也可作为中药材入药，同时可以直接食用，是药、茶、食三用的纯天然绿色食品保健品[3]。大量的研究和中药药典表明，滁州的滁菊药用价值很高，含有多酚类、黄酮类和萜类等活性物质，并且含有多糖和微量元素，适量使用后，能够起到抗氧化、抗肿瘤以及改善缺血心肌的血液供应等作用[4]。

目前，在菊花的品种鉴别、质量检测控制上已经引入了HPLC指纹图谱技术。陈晓庆等对滁菊的HPLC特征指纹图谱进行研究，对10个不同批次的滁菊进行实验，结果表明，不同批次的菊花之间所含化学成分存在显著差异，所以可见HPLC指纹图谱能够有效区分滁菊与其它菊花，且该方法快捷、准确、重复性好，可为滁菊药材的鉴别及质量控制提供理论依据[5]。于士军等对滁菊建立了HPLC指纹图谱，对其化学计量学进行分析和研究，结果表明，在滁菊的产地选择和质量评价技术上，可以采用HPLC指纹图技术[2]。本文主要对滁菊在不同冲泡温度下滁菊茶汤的浸提液建立滁菊茶汤生物HPLC指纹图谱，对不同冲泡温度下的滁菊茶汤浸出物进行主成分、聚类分析，旨在研究不同冲泡温度下对滁菊茶汤品质和浸出物的的影响，为合理冲泡和饮用滁菊茶提供参考和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 滁菊、甲醇（色谱纯）、磷酸（分析纯）、超纯水、DPPH、无水乙醇、硫酸亚铁、水杨酸-乙醇溶液、过氧化氢溶液、磷酸盐缓冲液、铁氰化钾溶液、三氯乙酸溶液，氯化铁溶液。芦丁（纯度95.5%）购于中国药品生物制品鉴定所。对照品木犀草苷（批号：MUST-15012204，质量分数>99.77%），绿原酸（批号：MUST-15041814，质量分数>99.39%）;槲皮素（CAS号：117-39-5，质量分数>98.00%）;芹菜素（CAS号：520-36-5，质量分数>98.00%）。

1.1.2 仪器与设备 Agilent1260II高效液相色谱仪、SpectraMaxPlus384全波长酶标仪、BPG-9070A鼓风干燥箱、KQ3200DA数控超声波清洗器、MINI-10K+微型离心机、HX-01N真空泵、FA2204B分析天平、此外还使用到一次性注射器、0.22μm滤膜、封口膜等。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 取4g的滁菊干茶分别放入18个锥形瓶中，依次加入温度为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，pH為6.0的蒸馏水200mL。摇匀，用保鲜膜对其进行封口，再分别放入相应温度的水浴槽中保温，浸提10min。最后用滤网将滁菊过滤，将过滤后的茶汤置于干净的烧杯中，待用。对滁菊溶出物HPLC指纹图谱的测定还需取上述各样液1mL，对样液离心沉淀杂质，再经0.22µm微孔滤膜过滤，收集滤液于液相样品瓶中待测。

1.2.2 滁菊溶出物HPLC指纹图谱的测定 （1）标准品溶液配制。分别称取干燥至恒重的对照品绿原酸2.4mg、木犀草苷0.8mg、槲皮素0.4mg、芦丁0.5mg、芹菜素0.5mg，置5mL棕色容量瓶中，加入75%甲醇溶解定容，配制成绿原酸浓度为480µg/mL、木犀草苷160µg/mL、槲皮素80µg/mL、芦丁100µg/mL、芹菜素100µg/mL的对照品溶液，超声30min，用0.45µm微孔滤膜将对照品溶液过滤，得待测溶液，备用。

（2）色谱条件。色谱柱：Eclipse Plus C18色谱柱（250mm×4.6mm，5µm）;流动相：0.4%磷酸水溶液（A）-甲醇（C）;流速：1mL/min;柱温：30oC;检测波长：320nm;进样量：10µL;采用梯度洗脱：0～5min，70%A;11min，62%A;17min，62%A;20min，58%A;22min，50%A;25min，40%A;30min，40%A;35min，70%A;37min，70%A。

2 结果与分析

2.1 HPLC指纹谱图的建立 采用6种温度按照“1.2.1”项的方法处理滁菊制备样品提取液，使用“1.2.2”中的色谱条件，对滁菊茶汤样品提取液进行测定。将指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）》进行分析，选择样品S2的指纹图谱为参照图谱，采用多样本平均数矢量综合作为共有模式矢量，时间宽度设定为0.50，对色谱峰进行多点校正和全峰匹配，得到指纹图谱，如图1。每种冲泡温度的滁菊茶汤平行实验3次，一共18个指纹图谱，共计20个色谱峰，其中有6个色谱峰是18个滁菊茶汤样品提取液所共有的。计算了各色谱峰相对峰面积，具体实验结果见表1。

从表1中的数据可以看到，100℃时20个出峰时间均出峰，而50℃时，出峰个数较少，随着冲泡温度升高，茶汤出峰的个数也随之增加。所以不同的冲泡温度对滁菊活性成分浸出量有影响。将表1中的色谱峰的出峰时间与标准品的色谱峰出峰时间对比之后，确定了样品中20个色谱峰中的5个色谱峰，其中峰号P4为绿原酸、峰号P10为木犀草甘、峰号P13为芦丁、峰号P14为芹菜素、峰号P18为槲皮素。

2.2 几种成分含量测定 由表2可知不同温度下，滁菊茶汤中的活性物质槲皮素、绿原酸、木犀草甘、芦丁和芹菜素含量存在显著性差异（p<0.05）。90℃时槲皮素的含量达到最大值为0.29mg/g，100oC时绿原酸、木犀草甘、芦丁、芹菜素的含量均达到最大值分别为7.58、1.03、0.55、1.85mg/g。从表2可看出，黄酮类活性物质槲皮素、木犀草甘、芦丁、芹菜素的含量和多酚类物质绿原酸的含量均随着温度的升高而增加，50℃和60℃时，5种活性物质的含量均不存在显著性差异（p<0.05），随着温度的升高，70℃时与50℃和60℃存在显著性差异（p<0.05），80℃、90℃和100℃时，槲皮素和绿原酸不存在显著性差异（p<0.05）;木犀草甘、芦丁和芹菜素在90℃和100℃时不存在显著性差异，但3种黄酮类物质的含量在冲泡温度为100℃和80℃时存在显著性差异。综上所述，不同的冲泡温度对滁菊茶汤中的活性物质的溶出量有影响，随着温度的升高而增加，槲皮素在90℃时达到最大值，100℃时保持不变，绿原酸、木犀草甘、芦丁和芹菜素4种活性物质均在100℃达到最大值。

2.3 化学计量学分析

2.3.1主成分分析 将HPLC-DAD指纹图谱20个峰面积数据导入SPSS 23.0软件，并对导入的数据进行主成分分析，具体实验结果见表3。因第三主成分的特征值只有0.584，没有超过1，所携带的信息量不到原来的1个变量，所以本研究提取表3中第一和第二两个主成分进行分析。

将HPLC-DAD指纹图谱20个峰面积数据导入SIMCA 14.1统计软件进行PCA分析，得到PCA主成分载荷图（a）、（b）2个分图（图2），得分图（a）、（b）2个分图（图3）。

图2的载荷图能比较明显的看出区分这些样品的关键变量点，与原点之间的距离越远，表示其与主成分之间的相关性越高，正方向表示正相关，负方向表示负相关。其中图（a）表示第一主成分和第二主成分的载荷图，图中可以看到色谱峰P1～P20与第一主成分都成正相关，其中与第一主成分相关性较高的有P1、P2、P3、P4、P5、P8、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19。与第二主成分成正相关的有P6、P7、P9、P11、P17、P20，其中相关性较高的有P6、P7、P17。图（b）表示第一主成分和第三主成分的载荷图，可以看到，与第三主成分相关性较高的是P11、P20。

根据图3（a）、（b）的2个主成分得分图可以看出，6种温度冲泡滁菊样品（每种冲泡温度有3个平行）大致集中在4个区域，每种冲泡温度均能够较好的聚在一起。从（a）图中可以看到冲泡温度为50℃和60℃的2组非常接近，且2种冲泡温度几乎重叠在一起;70℃、80℃和90℃较为接近，这3种冲泡温度有的重叠在一起;80℃和90℃分布在1个区域，而100℃独自分布在1个区域。图（b）中：50℃、60℃和70℃各自能很好的聚为一体，和图（a）一样50℃和60℃非常接近几乎重合;70℃和80℃比较接近;与图（a）不同的是图（b）中的90℃独自在1个得分区域，100℃和80℃在1个区域。综合分析可以得出，6种不同的冲泡温度对茶汤中的活性成分浸出量有着不同的影响，低温的冲泡温度为50℃、60℃和高温的冲泡温度为90℃、100℃有着很明显的区别，其中50℃、60℃较为接近，70℃和80℃也相对接近。

2.3.2 聚类分析 用SPSS 23.0统计分析软件对18个样品的20个峰面积进行标准化处理后，利用NCSS进行聚类分析，采用瓦尔德聚类法，距离的计算方法为欧氏距离，二维聚类分析结果见图4。

横向聚类结果为样品间的聚类分析，据图可知，在第1次聚类时，18个样品可聚为6类，即3个重复性试验可以很好的聚在一起。在距离为0～6.25之间，较低温度的50℃和60℃聚在一起，偏高温度的70℃和80℃聚在一起。当距离为6.25时，可以看到18个样品聚为3类，50℃和60℃聚为一类，70℃、80℃和90℃聚为一类，最高温度100℃为一类。距离为12.5时，70℃、80℃、90℃和100℃才聚为一类，低温与高温冲泡滁菊得到的茶汤差异较大，由图中可以看到距离达到25时，6种温度才可聚在一起。说明不同冲泡温度对滁菊茶汤中的活性成分溶出量有一定的影响，且高温与低温对滁菊茶汤的影响很明显，其中50℃和60℃对茶汤的影响非常接近，70oC和80oC对茶汤的影响较接近，该聚类结果与主成分分析的得分图结果基本一致。

纵向聚类结果为色谱峰聚类分析，据图可知，50℃和60℃的色谱峰P1～P20的峰面积都比较小，由图中的颜色梯度可以看到，相比高温的颜色，50℃和60℃为负值说明50℃和60℃ 2个温度的滁菊茶汤中的活性成分的溶出量较少。在70℃时，色谱峰中的P1、P2、P3、P5、P8、P9、P12、P15、P16、P19、绿原酸、槲皮素、芹菜素、木犀草甘、芦丁的峰面积由颜色梯度可以看到开始变为正值，说明峰面积增大，表示所代表的活性成分在茶汤中含量开始增大。随着温度增高，值为负值的峰面积也开始变为正值，其他的峰面积也在增大。当温度达到100℃时，色谱峰P1～P20的峰面积基本上都是正值并达到最大值，即所代表的活性成分含量最大，这表明温度越高活性成分的溶出量越大。综上所述，高温和低温冲泡滁菊，其茶汤中活性成分差异较大，说明不同的冲泡温度对滁菊茶汤中活性成分的溶出量有较大的影响。

3 结论

通过对不同冲泡温度下滁菊茶汤的HPLC指纹图谱的化学计量学分析，表明不同冲泡温度下的滁菊茶汤品质和HPLC指纹图谱是存在显著差异的，随着冲泡温度的升高，茶汤活性物质含量越高，并在100℃时达到最大值，100℃时茶汤的各项指标基本都显示最好，所以本研究中100℃为滁菊茶汤的最优冲泡温度，可以得到较好品质的滁菊茶汤。

参考文献

[1]张蓓蓓，陈岩，贲培玲.滁菊总黄酮研究进展[J].齐齐哈尔医学院学报.2016，37（17）：2211-2213.

[2]于士军，王伟，孙辉，等.滁菊的HPLC指紋图谱制作及其化学计量学分析[J].生物资源.2017，39（3）：185-191.

[3]吴越.滁菊中有效成分的检测方法研究概述[J].安徽农学通报.2017，23（19）：16-17.

[4]尹智慧.不同产地药用菊花有效成分溶出规律研究[D].杭州：浙江中医药大学，2015.

[5]陈晓庆，刘家水，张丹雁.滁菊HPLC特征指纹图谱研究[J].广东药科大学学报.2017，33（5）：611-616.

基金项目：安徽省长三角创新联合公关专项（107085328028）、滁州市科技指导性计划项目（2021ZD024）。

作者简介：张俊巍（1985—），男，安徽宣城人，农艺师，从事农业产业化、农产品质量安全工作。

通讯作者：于士军（1983—），男，安徽临泉人，副教授，主要从事天然产物和食品质量安全方面的研究和教学工作。  收稿日期：2022-02-28