典型藏茵陈原植物（川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾）分子水平的研究进展

董志强 杜少波 陈晓文 谢惠春

摘 要：藏茵陈是藏族药物历史悠久的八珍藏药之一，具有清热、解毒、清肝利胆的功效。藏茵陈分为獐牙菜属、花锚属、扁蕾属等，其中川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾分别为其属中最具有代表性的植物，药效佳，受到了越来越多的欢迎。近年来，药用植物在分子水平生物合成机制与调控、分子标记技术、次生代谢产物生物合成途径（基于转录组测序技术）等方面的研究已然成为现如今分子水平研究中最活跃、最热点的领域。该文通过查阅近年文献，从生物合成分子机制与调控、分子标记技术、次生代谢产物生物合成途径（基于转录组测序技术）等方面对3种典型藏茵陈植物（川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾）的研究进展进行了综述与展望，为其今后在分子水平上相关机制的研究提供参考。

关键词：獐牙菜;川西獐芽菜;椭圆叶花锚;湿生扁蕾;分子调控机制

中图分类号 R282 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）11-0013-04

Research Progress on Molecular Level of Typical Original Plants of Tibetan Wormwood（Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa）

DONG Zhiqiang   DU Shaobo   CHEN Xiaowen   XIE Huichun

（Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Qinghai Province， Qinghai Normal Unversity， Xining 810008， China）

Abstract： Tibetan Herba Artemisiae Scopariae is one of the eight Tibetan medicines with a long history of Tibetan medicine， which has the effects of clearing away heat， detoxifying， clearing away liver and benefiting gallbladder. Tibetan Artemisia can be divided into Swertia， Anthurium and Flaveria， among which Swertia in western Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa are the most representative plants with the best efficacy， which have gained more and more popularity. In recent years， the research on molecular mechanism and regulation of biosynthesis in medicinal plants， molecular marker technology and biosynthetic pathway of secondary metabolites （based on transcriptome sequencing technology） have become the most active and hot fields in molecular level research. In this paper， the research progress of three typical Tibetan Artemisia plants （Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa） was summarized and prospected from three aspects， such as the research on molecular mechanism and regulation of biosynthesis， molecular marker technology， and biosynthetic pathway of secondary metabolites （based on transcriptome sequencing technology）， so as to provide reference basis for the related mechanism research at molecular level in the future.

Key words： Swertia; Swertia mussotii; Halenia elliptica D.; Gentianopsis paludosa; Molecular regulation mechanism

藏茵陈，藏药名“桑蒂”“蒂达”，始载于藏医药书《四部医典》，具有清热解毒、清肝利胆的功效，在历代的藏医药著作如《晶珠本草》《鲜明注释》等均有记载[1]。广义的藏茵陈主要包括獐牙菜属Sweriat、花锚属Halellia、扁蕾属Gentianopsis等[2]。其中，川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾是其各自属属中最具有代表性的植物，是藏茵陈入药原植物中的主要植物，有关它们的化学成分组成、药理作用方面的研究文献报道数不胜数[3]。川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾均以全草入药，味苦、性寒，均具有清热利湿、平肝利胆作用，均是藏医临床治疗肝胆疾病的常用药物[4]。川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾的主要化学成分均为呫吨酮及其苷、裂环烯醚萜类、三萜类及黄酮苷等化合物，另外还含有齐墩果酸等，具有保肝、抗氧化、抗病毒、抗炎性反应、降血糖、抗癌、抗肿瘤、抗纤维化等作用[5]。由于近年來传统藏药被认为对治疗相关疾病具有较好的疗效，传统藏药的开发与利用具有巨大的上升空间，对其的研究与发展也受到了社会各界的广泛关注[6]。

近年来，药用植物在分子水平上的研究成日益增多，尤其对于验证和探讨发现药用植物相关生物合成途径以及相关次生代谢产物合成途径中的关键酶、关键基因、关键蛋白等，通过对其分子调控机制的研究可以有效地揭示药用植物中内源合成机制以及调控系统，真正探讨出关键化合物合成的机制与其必要的途径，为合成重要的化合物提供基础[7]。其中，转录组测序技术已成功应用于动物、植物、微生物等各类生物当中，主要涉及疾病研究、关键基因发掘及基因剪切等方面[8]，以及利用pcr、western bolt等技术[9]验证相关通路的分子机制研究成为目前对药用植物药效分析及生物合成的分子机制的研究热点，具有较大的发展潜力。对其挖掘功能基因、探究药用植物有效成分生物合成的分子机制、开发新的药用植物资源及分子辅助育种技术等都具有重要的意义[10]。本文通过查阅近年文献，分别对3种藏茵陈入药原植物（川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾）从生物合成分子机制与调控研究、分子标记技术研究、次生代谢产物生物合成途径（基于转录组测序技术）3个方面的研究进展进行系统梳理，为今后藏茵陈原植物的研究提供参考。

1 生物合成分子机制与调控

生物合成机制调控中活性成分在药用植物中具有重要作用，其生物合成途径解析的挖掘也已成为药用植物研究的主要目标之一。川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾的活性成分中的（口山）酮类、三萜类、环烯醚萜类、黄酮类[11]均被公认为对治疗肝病、炎症、肿瘤、癌症等有着明显的疗效。目前，关于生物合成的通路及关键酶及关键基因等调控机制大多数源于上述几种活性成分。

杜晓煌[12]等用川西獐芽菜醇提活性物质来验证肝细胞胆汁酸转运蛋白Mrp4（multidrug resistance-associated protein4，Mrp4）、转录因子Nrf2的调控作用，通过RT-qPCR、Western blot检测大鼠肝脏细胞膜转运蛋白Mrp4、Mrp3及相关核受体在mRNA和蛋白水平的表达变化，均发现Mrp4、Mrp3、Nrf2的表达均增高，表示这种调控作用可能与Nrf2相关。Wu J[13]等通过对川西獐芽菜中环烯醚萜类中的獐芽菜苦苷成分进行提取，验证其对缺氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGDR）刺激的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的潜在神经保护作用，通过Western blot方法对TLR4相关蛋白进行测定，发现提取物可以降低TLR4、MYD88、NF-KBp65和PARP1的表達，说明獐芽菜苦苷可以通过TLR4/PARP1/NF-KB途径减轻ROS水平升高和抑制凋亡，从而保护SH-SY5Y细胞免受OGDR诱导的损伤。谭湘姗[14]等利用椭圆叶花锚化学成分中的1-羟基-2，3，5-三甲氧基（口山）酮（HM-1），探索其在大鼠肝脏微粒中的代谢途径，通过采用大鼠肝脏微粒体温孵体系，结合高效液相-离子阱-飞行时间质谱技术（LC/MSn-IT-TOF），对其产生的6个代谢产物通过肝药酶细胞色素P450筛选的5个主要的CYP450酶亚型，即CYP1A2，2C9，2D6，2E1和3A4在HM-1中进行抑制率情况进行统计，发现5个CYP450酶亚型均介导了HM-1在大鼠肝脏微粒体中的代谢，其中CYP2C6/11与CYP3A2最为明显，推测其可能是参与HM-1在大鼠肝脏微粒体代谢的主要CYP450酶。王昕[15]等通过对椭圆叶花锚的总黄酮进行提取，构造肝纤维化大鼠模型肝星状细胞（HSC），由于α-肌动蛋白（α-SMA）的高表达可以增强HSC的活化，造成肝纤维化及肝硬化，研究发现，椭圆叶花锚总黄酮提取物可以降低HSC激活标志物α-肌动蛋白（α-SMA）的表达，造成HSC凋亡，这可能是抗肝纤维化的一条有效途径。赵慧巧[16]等通过用湿生扁蕾的提取物来探讨NF-KB信号通路诱导结肠癌SW480细胞凋亡的作用及其机制，利用Hoechst染色以及检测NF-KB蛋白的表达量发现一定浓度的湿生扁蕾提取物经过处理后，在SW480细胞中，NF-KB的表达明显下调，表明湿生扁蕾可能通过NF-KB信号通路来介导的肿瘤机制，造成肿瘤细胞凋亡。

2 SSR分子标记技术

SSR分子标记技术[17]在药用植物基因组中散布着大量的串联重复序列，具有多态性高、重复性好、共显性、覆盖面广、易检测、操作简单等优点，已经在遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种、遗传多样性分析和品种及纯度鉴定等方面得到了广泛应用。SSR分子标记技术作为高通量测序技术提供前导性研究，也为验证相关次生代谢产物的关键基因以及相关通路做铺垫，起到了至关重要的作用[18]。

刘越[19]等利用MISA（MicroSAtelite）软件对川西獐牙菜转录组序列68787条跨叠群（contigs）进行简单重复序列（SSR）位点的挖掘，发现5099条序列中含有5610个SSR位点，其中三核苷酸重复基源最高，其次为二核苷酸，SSR主要以5～10次重复为主，长度集中在12～30bp，结果发现川西獐牙菜转录组SSR的出现频率高，重复类型丰富，表明川西獐芽菜SSR具有较高的可用性。Zhang[20]等利用磁珠富集法（FIASCO）开发了12个椭圆叶花锚的多态性微卫星DNA（microsatellite DNA，亦称SSR），这些引物在备检的一个异型花个体上也表现出通用性。Yang等利用NGS Illumina技术得到椭圆叶花锚的转录组，其中32109单基因成催化功被扫描，形成了简单重复序列（SSRs），并对其进行注释，发现其在细胞成分组成、催化活性因子、结合因子以及细胞代谢过程中表现最为丰富。此外，还通过设计SSR引物进行PCR扩增，鉴定其在8个种群40个个体样本中的多态性差异，发现椭圆叶花锚亲缘关系与地理距离之间存在显著性差异，具有系统的地理结构，还证明了椭圆叶花锚与滇黄芩具有亲缘性关系，存在跨物种转移的能力，为研究椭圆叶花锚与其近缘性物种的遗传多样性和种群历史提供了有价值的资料。王久利[21]等利用SR search软件检测椭圆叶花锚得到5种类型的SSR（二、三、四、五、六核苷酸）位点共6201个，并成功设计其中3865个SSR引物，从中挑选出65对可对应的引物。通过椭圆叶花锚的4个居群32个个体进行pcr和聚丙烯酰氨凝胶电泳验证后，发现其中14对引物能在绝大多数个体中扩增，且13对具多态性，从而得到了椭圆叶花锚近缘类群的一个值得参考的数据库。

3 次生代谢产物生物合成途径（基于转录组测序技术）

次生代谢产物[22]是药用植物的重要组成部分，其种类繁多，主要包括含氮有机物、生物碱、萜类、酚类、黄酮类及有机酸等。药用植物具有作用靶点多，组分复杂的特点，通过转录组测序解析次生代谢产物生物合成途径并挖掘关键酶基因，可为药用植物活性成分的积累和高效利用提供科学依据。

李晓雪[23]等利用川西獐芽菜叶片cDNA为模板，进行pcr扩增，得到特异性片段，并将特异性片段与Peasy-Blunt Simple Clonging Vector连接，进行高通量测序，通过序列对比及生物统计学方法分析验证了7-脱氧马钱子酸羟化酶（SmDL7H）被成功克隆，7-脱氧马钱子酸羟化酶（SmDL7H）是川西獐牙菜裂环烯醚萜合成途径中关键酶，它的成功克隆为研究裂环烯醚萜类化合物合成途径奠定基础。Li WJ[24]等通过川西獐芽菜转录组数据，克隆DXS2基因（基因库编号MH535905），命名为SmDXS2。因为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶2（DXS2）是MEP途径的第一个关键酶，在植物萜类生物合成中起到重要作用，实验结果显示，克隆的SmDXS2蛋白与龙胆DXS2蛋白同源，与预期大小一致，为研究环烯醚萜类化合物合成及代谢通路做铺垫。Liu Y[25]等通过高通量技术对川西獐芽菜根、茎、叶、花的转录组进行测序，进行GO和KEGG在内的注释数据库的BLAST搜索，通过qRT-PCR验证了39个编码环烯醚萜生物合成关键酶的候选转录本在不同组织中的表达谱，发现在川西獐芽菜不同部位的基因存在较大的表达差异性，其中7DLGT基因的表达水平与其他基因显著不同，它的低表达可能说明其是在裂环烯醚萜代谢途径中的限速酶，SLS基因与川西獐芽菜中的2个同源SLS基因表达模式不同，但是否具有功能差异还不得而知，为进一步挖掘调控药用成分次生代谢产物合成的关键酶基因奠定基础。

4 结论与展望

本文从生物合成分子机制与调控、分子标记技术、次生代谢产物生物合成途径（基于转录组测序技术）等方面梳理了国内外近年来在3种上的典型藏茵陈植物（川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾）研究成果。结果显示，生物合成分子机制与调控有助于得到新的功能基因和代谢通路，为天然药物来源新途径，种质资源鉴定、保存、扩大与优良种质选育提供分子基础。SSR分子标记的开发，通过构建药用植物指纹图谱，为分子标记辅助育种，种质资源收集、鉴定与评价提供技术支撑。次生代谢产物生物合成途径可以通过转录组测序技术了解其次生代谢产物的生物合成途径的分子机制及其合成所需的关键酶基因，为进一步研究次生代谢调控奠定了基础，推动了药用植物次生代谢工程的发展。但也存在不足之处，其中川西獐芽菜在分子水平上的相关研究进展均超过了椭圆叶花锚及湿生扁蕾，这可能与川西獐芽菜被广泛认为是藏茵陈的正品有关。但随着野生资源被破坏严重，无法得到有效保护，导致其濒临灭绝，而通过对其基源性植物的开发与探索，也能取得不错的成果，解决燃眉之急。其中，椭圆叶花锚在转录组测序方面也只有相关分子标记的研究，而湿生扁蕾更甚，在转录组测序方面上几乎没有文献报道，但其在治疗结肠癌方面有着显著疗效，这些都说明3种典型藏因陈植物（川西獐芽菜、椭圆叶花锚、湿生扁蕾）在分子水平的研究都具有局限性，应当在其后的研究中多多探讨，尤其是在转录组测序方面，可以通过测序药用植物不同部位、不同地点、不同海拔等系列条件，寻找差异表达基因，从而进一步确定验证相关生物合成以及次生代谢物的关键基因、关键蛋白等，结合新兴的蛋白质组学、代谢组学研究，实现高通量与高效率的结合，助力传统中藏药的现代化进程。

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基金项目：科技部“第二次青藏高原综合科学考察研究”生命地球化学循环与环境健康专题（2019QZKK0606）;青海省重大科技专项青海生态环境价值评估及大生态产业发展综合研究（2019-SF-A12）;青海省科技厅青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室（2020-YJ-Y40）;基于道地演变的5种多基源中藏药材品质评价及转录组研究（2017-ZJ-774）;中国科学院2018年度“西部之光”人才培养引进项目（人字[2018]99号）。

作者简介：董志强（1996—），男，河南三门峡人，硕士研究生，研究方向：生态学。

通讯作者：谢惠春，男，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：青藏高原动植物资源。  收稿日期：2021-12-21