一株芘降解菌的分离鉴定及其特性初步研究

张天宇 王美琴 刘龙祥 任丽丽 马燕阳 翟振龙 樊平 吴涛

摘 要：以黄河三角洲重盐碱地原油污染区健康生长的盐生植物芦苇、稗草、盐地碱蓬为材料，采用芘为碳源，分离筛选具有芘降解功能的植物内生细菌，并研究其促进植物生长的特性。结果表明，筛选得到7株植物内生细菌具有溶解有机磷能力，7株菌7d对多环芳烃芘的降解率为59%～78%，其中菌株LDD3的降解效果较为显著，降解率达到78%。经分子鉴定，菌株LDD3为施氏假单胞菌，在WB培养基和芘培养基中对数生长期分别为4～16h、24h～48h，最适生长盐度范围为1%～3%。

关键词：植物内生细菌;芘;降解;施氏假单胞菌

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）11-0029-04

Isolation， Identification and Characterization of a Pyrene Degrading Strain

ZHANG Tianyu1   WANG Meiqin1   LIU Longxiang1   REN Lili1   MA Yanyang1   ZHAI Zhenlong1

FAN Ping2   WU Tao1，3

（1Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta， College of Biological and Environmental Engineering， Binzhou University， Binzhou 256600， China; 2Binzhou Agriculture and Rural Bureau， Binzhou 256601， China; 3Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta， Binzhou University， Binzhou 256600， China）

Abstract： Using the healthy halophytes Phragmites australis， Echinochloa crusgalli and Suaeda salsa growing in the heavy saline alkali soil oil polluted area of the Yellow River Delta as materials and pyrene as carbon source， the plant endophytic bacteria with pyrene degradation function were isolated and screened， and their plant growth promoting characteristics were studied. The results showed that the seven strains of plant endophytic bacteria had the ability to dissolve organic phosphorus. The degradation rate of polycyclic aromatic pyrene was 59%～78% in 7 days， and the degradation rate of strain LDD3 was 78%. By molecular identification， strain LDD3 was Pseudomonas schneider. The logarithmic growth periods of LDD3 in WB medium and pyrene medium were 4～16h and 24h～48h respectively. The optimum growth salinity range of strain LDD3 is 1%～3%.

Key words： Plant endophytic bacteria; Pyrene; Degradation; Pseudomonas schneider

多环芳烃（PAHs）是一类常见的具有“三致效应”的有机污染物，主要来源于化石燃料燃烧、生活垃圾焚烧以及化工行业排放的废弃物等，容易在土壤中累积，同时能够通过地球化学循环进入大气、水体，造成二次污染[1]。PAHs具有较强的稳定性、脂溶性和累积性，极易被动物肠胃吸收，并通过食物链放大而富集[2]。因此，控制和治理PAHs污染是当前面临的重要的环境问题之一。当前，PAHs污染土壤治理方法主要有物理、化学、生物修复，其中生物修复相比于物理、化学修复，具有经济简便、环境友好及无二次污染的优点，是修复环境中PAHs污染最具前景的方法，能够降解PAHs污染物特性植物内生细菌的发现，为植物修复PAHs污染带来了新的研究方向。目前，研究人员已从植物中筛选出若干种可促进植物代谢体内PAHs污染物的功能内生细菌，这些研究主要集中在萘、菲等低分子量PAHs污染物。芘是由4个苯环对称排列组成的PAHs，作为高分子量PAHs，其在环境中稳定存在[3]。目前，筛选分离降解芘等高分子量多环芳烃的植物内生细菌研究还少有报道。

本研究以黄河三角洲重盐碱原油污染地区健康生长的盐生植物（稗草、盐地碱蓬、芦苇）为材料，采用芘为PAHs代表物，分離筛选出具有芘降解功能的植物内生细菌，利用分子生物学技术对其鉴定，并研究其促生和耐盐特性，为PAHs污染土壤的生物修复提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料 植物样品采自黄河三角洲地区油井旁盐渍化土壤上健康生长的芦苇、稗草、盐地碱蓬。

1.2 培养基 SL-6（g/L）：ZnSO4·7H2O 0.10，MnCl2·4H2O 0.03，H3BO3 0.30，CoCl2·6H2O 0.20，CuCl2·2H2O 0.01，NiCl2·6H2O 0.02，Na2WO4·2H2O 0.03，pH为7.8±0.2。

SL-4（g/L）：FeSO4·7H2O 0.002，10%微量元素溶液SL-6。

无机盐培养基（g/L）：Na2HPO4·12H2O 17.90，NaH2PO4·2H2O 7.80，（NH4）2SO4 5.00，KCl 5.00，1%微量元素溶液SL-4。

WB培养基：LB培养基与无机盐培养基进行1∶1比例混合制备而成。

蒙金娜有机磷培养基配方参照文献[4]方法。

PKO无机磷培养基配方参照文献[4]方法。

1.3 芘降解菌的分离 新鲜植物样品用自来水冲洗35min，再用无菌水冲洗4次，每次冲洗时间4min。用灭菌滤纸吸干植物表面水分，用无菌剪刀将植物分为地上部和地下部，分别用70%酒精浸泡2min，无菌水清洗4次，3%NaClO浸泡2次，每次浸泡时间为1min，再用无菌水清洗4次，每次3min。经以上处理完的样品放在LB固体培养基上，培养24小时之后，检测表面是否灭菌完全[5]。将上述样品分别称量5g，加入10倍体积PBS溶液，研磨，吸取5mL上清液转到50mL浓度为50mg/L的芘培养基中，25℃，180r·min-1培养3d，转接5次，梯度稀释，涂布，25℃恒温培养。待长出单菌落后纯化3次，得到功能菌株[6]。

1.4 高效芘降解菌株的筛选 将分离纯化得到的菌株接种于含芘液体培养基，设置3个对照，每株菌设3次重复。28℃、160r/min条年下振荡培养7d，测定培养基中芘浓度。培养基中芘浓度测定方法：将含芘无机盐培养基转入100mL离心管，加等体积正己烷，涡旋振荡1min，静置，取有机相用0.22μm有机滤膜过滤，硅胶柱纯化，用高效液相色谱仪测定芘含量。高效液相色谱条件：C18反相色谱柱，流动相V（甲醇）∶V（超纯水）=80∶20，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长254nm，进样量20μL，时间12min。

1.5 菌种鉴定 菌种分子鉴定由中美泰和公司进行，利用邻接法在MEGA.7软件上构建系统发育树。

1.6 菌株溶磷特性试验 分别以Ca3（PO4）2、卵磷脂代表无机磷和有机磷。采用点接法接种于有机磷和无机磷固体培养基上，在恒温培养，观察是否产生溶磷透明圈。

1.7 生长及耐盐特性 生长曲线测定：准确吸取10mL细菌过夜培养液（培养10～12h），按照5%接种量接种到190mLWB培养基或者，28℃、160r/min培养，每隔2h取样，在600nm下测定吸光度。设置无菌组作为对照，每株菌设置3个重复。菌株在芘培养基条件下的生长曲线操作步骤同WB培养基，取样时间每隔为12h。耐盐特性：吸取1mL对数期的菌悬液分别接种到NaCl浓度为1%、3%、5%、7%、9%、11%的10mLWB培养基中，设置3个重复。在160r/min、28℃条件下振荡培养至对数期，600nm测其吸光度。

2 结果与分析

2.1 分离筛选的芘降解菌 通过选择性富集培养，从黄河三角洲盐渍化石油污染区健康植物体内分离筛选出7株具有芘降解功能的植物内生细菌，编号分别为LDD3、YDB1、LDB7、YUA6、LDB11、LUD5、LDC7。通过摇瓶培养，测定菌株降解芘能力，各株菌降解对芘的降解率如图1所示。由图1可知，7株菌对芘的降解率均达到55%以上，其中LDD3对芘的降解率最高，达到78%。因此，选择菌株LDD3作进一步研究。

2.2 芘降解菌株溶磷能力 将高效降解菌LDD3分别点接于无机磷和有机磷培养基平板上，培养7d后，菌株在有机磷培养基上产生溶磷透明圈，在无机磷培养基上未产生溶磷圈，说明菌株LDD3具有溶解有机磷的能力。

2.3 芘降解菌株所属菌种鉴定 菌株LDD3经16S rDNA基因测序，得到碱基序列，在GenBank数据库中比对，菌株LDD3与已报道的多株假单胞菌属（Pseudomonas）同源性达到99%以上，与施氏假单胞菌同源性达到100%，确定其为施氏假单胞菌，利用邻接法通过MEGA.7软件构建系统发育树，结果如图2所示。

2.4 生长及耐盐特性 LDD3在WB培养基和芘培养基中的生长曲线结果如图3所示。由图3可知，菌株LDD3在WB培养基条件下0～4h内生长缓慢，4～16h生长较快，16h后达到稳定生长期。在芘培养基中24～36h达到对数生长期，36～48h生长稳定，84h后菌株开始衰亡。

不同NaCl浓度下菌株LDD3生长情况如图4所示。由图4可知，随NaCl浓度的增加，LDD3的生长呈下降趋势。在1%、3%NaCl浓度下生长的最好，5%NaCl浓度抑制菌株的生长，表明菌株LDD3最适生长盐度范围为1%～3%。

3 讨论

PAHs微生物降解一直是国内外研究的热点，而微生物具有生长周期短、易于驯化培养、种类丰富等优点，其在PAHs的生物修复、转化及清除中具有良好的应用前景。因此，筛选高效降解菌是修复PAHs污染环境的关键环节[7]。本研究通过选择性富集培養法筛选7株具有芘降解功能的植物内生细菌，在芘培养基中摇床培养及高效液相色谱仪测定，复筛得到高效降解芘的植物内生菌LDD3，通过16S rDNA基因测序比对分析LDD3为施氏假单胞菌（Pseudomonas Schneider）。

LDD3具有溶解有机磷的能力，最适生长盐度范围为1%～3%，7d对芘降解率达到78%。王静[8]等从天津港石油污染区筛选的B5具有良好的芘降解性能，在培养36h对芘（150mg/L）的总降解率高达96.3%。冯清敏[9]等筛选的Pseudomonas sp.M4，以原油为共代谢基质时芘的降解率最高，30d降解率达61.23%。徐虹[10]等筛选的10号菌株在在混合反应体系中培养30d后芘的降解率为80%，在只含一种PAH的单反应体系中该菌对芘的降解能力则降低，降解率仅为62.47%。与混合PAHs培养体系相比，在单一PAHs培养体系中，细菌的对数生长期缩短1/3。环境中的PAHs多以混合物的形式存在，此前的研究发现，在生长培养基中添加额外的碳源可以提高细菌对芳香族化合物的降解效率[11]。共代谢是自然环境中重要的代谢机制[12]。大多数微生物无法利用多环芳烃作为唯一的碳源，但在其他低分子量营养物的存在下表现出降解能力[12]。共代谢作用是微生物降解多环芳烃的重要手段，冯清敏等[9]进行了共代谢实验，结果表明，相较于饱和烃和芳烃，以原油为共代谢基质可增强其所筛选菌株M4对芘的共代谢作用。本研究采取芘作为唯一碳源培养基，未涉及其共代谢作用机制研究，下一步将研究多种PAH为碳源条件下LDD3的降解特性。

4 结论

从黄河三角洲重盐碱原油污染地区健康生长的、芦苇、稗草、盐地碱蓬内分离筛选出具有芘降解功能的植物内生细菌7株，筛选得到的7株降解芘的植物内生菌都具有溶解有机磷的能力。通过高效液相色谱仪测定菌株LDD3降解芘能力较强，7d对芘降解率达到78%。经16S rDNA基因分子鉴定，LDD3为施氏假单胞菌。LDD3在WB培养基和芘培养基中的生长曲线，对数生长期为4～16h，耐盐度范围为1%～3%。通过对该菌促生和耐盐特性的初步研究，为PAHs污染土壤的生物修复提供技术支撑。

参考文献

[1]潘云飞，唐正，彭欣怡，等.石油烃污染土壤微生物修复技术研究现状及进展[J].化工进展，2021，40（08）：4562-4572.

[2]吕亚辉，黄友良，陈泽雄，等.一株芘降解菌的分离鉴定[J].生态环境学报，2020，29（09）：1890-1896.

[3]龚莹，王海花，马思远，等.海南红树林沉积物中多环芳烃降解菌群组成及降解率的比较研究[J].生态环境学报，2020，29（05）：1005-1013.

[4]徐娜娜. pH混合菌对多环芳烃的吸附、摄取及生物降解[D].青岛：中国海洋大学，2014.

[5]Zheng K，Fan J，Hu X，et al. Distribution by influence factors of pyrene removal in chemical enhancers assisted microbial phytoremediation of Scirpus triqueter in co-contaminated soils[J].International Journal of Phytoremediation，2019：1-7.

[6]范瑞娟，刘雅琴，张琇.嗜盐碱高环PAHs降解菌的分离及其降解特性研究[J].农业环境科学学报，2019，38（06）：1280-1287.

[7]靳竞男.多环芳烃降解菌的筛选及基于靶标酶结构的降解机制研究[D].北京：北京科技大学，2017.

[8]王静，邱金泉，张雨山，等.1株分离自海水中芘降解菌的鉴定及其降解特性研究[J].海洋学研究，2011，29（01）：49-55.

[9]冯清敏，王子豪，唐家璇，等.一株芘好氧降解菌的筛选鉴定及共代谢特性研究[J].化学与生物工程，2021，38（06）：44-50，67.

[10]徐虹，章军，刘陈立，等.PAHs降解菌的分离、鉴定及降解能力测定[J].海洋环境科学，2004（03）：61-64.

[11]Gulvik，C.A.，Buchan，A. Simultaneous catabolism of plant-derived aromatic compounds results in enhanced growth for members of the Roseobacter lineage. Appl. Environ. Microbiol，2013：79：3716–3723.

[12]Labana，S.，Kapur，M.，Malik，D.K.，et al.Diversity，biodegradation and bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons. In：Singh，S.N.，Tripathi，R.D. （Eds.），Environmental Bioremediation Technologies[J].Springer Berlin Heidelberg，Berlin，Heidelberg，2007：409–443.

基金項目：山东省重点研发计划（2019GSF109036）;国家自然科学基金项目（41977124）;山东省高等学校青创科技支持计划（2020KJD005）;山东省大学生创新创业训练计划项目（S201910449067）。

作者简介：张天宇（2001—），女，山东德州人，本科，研究方向：污染土壤生物修复。

通讯作者：吴涛（1980—），男，山东济南人，博士，教授，研究方向：有机污染土壤修复。  收稿日期：2021-12-21